3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.2.4 Thiết kế vectơ chọn lọc tích cực mang kết cấu gen Ubi-cryIA(c)
Việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thờng cần sự có mặt của các gen chỉ thị nh các gen kháng kháng sinh, chất diệt cỏ.... Nhằm tránh sử dụng các gen kháng kháng sinh này, hệ thống chỉ thị chọn lọc tích cực “Positech” rất mới của Công ty Syngenta đã dựa trên gen mã hoá phosphomannoza isomeraza (PMI) làm chỉ thị và chọn lọc các thể sau biến nạp nhờ khả năng sinh trởng trên môi trờng chứa mannoza [33].
Trên cơ sở Ubi-cryIA(c)-NOST và vectơ chọn lọc tích cực pNOV2819 nhận đợc từ Công ty Syngenta, chúng tôi đã tiến hành thiết kế plasmit tái tổ hợp mang gen
cry. Vectơ pNOV2819 với nhiều vị trí cắt duy nhất của enzym hạn chế giúp dễ dàng đa các gen quan tâm vào. Chúng chứa chỉ thị chọn lọc vi khuẩn là gen kháng Spectinomycin 50 μg/ ml nằm ngoài đoạn biên phải và trái. Đối với chỉ thị chọn lọc thực vật, gen mã hoá PMI kích thớc 514 bp đợc đoạn khởi động dạng cơ định CMPS (Cestrium Yellow Leaf Curling Virus) điều khiển biểu hiện mạnh ở các cây trồng thử nghiệm nh: ngô, lúa, lúa mỳ, đậu tơng, thuốc lá, cà chua, hớng dơng và cây cà. Với cặp mồi đặc hiệu để tiến hành PCR xác định sự có mặt của gen mã hoá PMI: PMI-1 5’-ACAGCCACTCTCCATTCA-3’, PMI-2 5’-GTTTGCCATCACTTCCAG- 3’, plasmit tái tổ hợp dễ dàng đợc phát hiện trong các thể tái tổ hợp. Vùng MCS của pNOV2819 có vị trí cắt của enzym Hind III, do vậy, toàn bộ kết cấu gen Ubi-
cryIA(c)-NOST có nguồn gốc từ plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) đợc chúng tôi đa vào
Hình 3.21. Sơ đồ thiết kế vectơ chọn lọc tích cực pNOV-Ubi-cryIA(c)
vectơ pNOV2819 dới dạng đoạn Hind III, kích thớc 4,1 kb. Sơ đồ thí nghiệm đợc trình bày trên hình 3.21.
Plasmit tái tổ hợp sau khi thiết kế đợc biến nạp vào chủng E. coli DH5α. Trên môi trờng LB có bổ sung Spectinomycin, chúng tôi đã thu đợc khá nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết ADN plasmit của các khuẩn lạc này. Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmit kích thớc lớn hơn pNOV2819, chúng tôi đã xử lý enzym hạn chế. Mẫu đối chứng là plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) cắt bởi các enzym tơng ứng. Theo tính toán lý thuyết, băng tơng ứng xuất hiện đồng thời ở mẫu đối chứng và thí nghiệm khi xử lý bằng EcoR I có kích thớc khoảng 2,2 kb (bao gồm kích thớc của gen cryIA(c) và một phần của đoạn khởi động Ubiquitin). Sản phẩm cắt tơng
Hình 3.22. Kết quả thiết kế vectơ chọn lọc tích cực pNOV-Ubi-cryIA(c)
1. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 2. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 3. Chỉ thị phân tử 1 kb
4. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ EcoR I 5. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ EcoR I
ứng bởi Hind III có kích thớc khoảng 4,1kb (kích thớc của kết cấu gen Ubi-
cryIA(c)-NOST). Kết quả trên hình 3.22 hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ chúng tôi đã đa đợc kết cấu gen cry vào vectơ pNOV2819 và tạo đợc plasmit tái tổ hợp pNOV-Ubi-cryIA(c).