3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.3.1 Tạo chủng A tumefaciens mang các Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300 Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) bằng phơng pháp xung điện
Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) bằng phơng pháp xung điện
Phơng pháp chuyển gen trực tiếp vào tế bào A. tumefaciens qua xung điện hay sốc nhiệt đều cần tạo tế bào khả biến. Mặc dù phơng pháp sốc nhiệt tiến hành khá đơn giản nhng hiệu quả tơng đối thấp nên với các thiết bị của Phòng máy chung của Viện Công nghệ Sinh học, chúng tôi đã sử dụng phơng pháp xung điện để chuyển Ti-plasmit mang các kết cấu gen thiết kế đợc vào tế bào A. tumefaciens.
Để có tế bào khả biến A. tumefaciens, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy lại các chủng vi khuẩn trên môi trờng thạch đặc YEP trớc khi cấy chuyển liên tiếp hai lần sang môi trờng lỏng có bổ sung 0,1 % glucoza.
Sau khi xử lý bằng xung điện (ở điều kiện 25 àF; 400 Ω; 2,42 kV; 8-10 ms), mẫu thí nghiệm và đối chứng đều đợc phục hồi ngay trong môi trờng tăng cờng. Trên các môi trờng chọn lọc (YEP + Km cho chủng EHA105 và YEP + Km + Rifampicin (Rf) + Carbenicillin (Cb) cho chủng LBA4404) sau hai ngày nuôi cấy, chúng tôi đã thu đợc khá nhiều khuẩn lạc. Hình 3. 23 là kết quả xung điện chuyển Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c) vào tế bào A. tumefaciens chủng EHA105.
Hình 3.23. Kết quả xung điện tạo chủng A. tumefaciens EHA105 chứa pC1300-Ubi-cryIA(c)
Các khuẩn lạc A. tumefaciens tạo đợc nhờ xung điện có chứa Ti-plasmit tái tổ hợp đợc phát hiện bằng phơng pháp chọn lọc trên môi trờng đặc hiệu, tách chiết ADN plasmit, biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành các thí nghiệm phân tích
phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bớc biến nạp trở lại ADN plasmit vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lợng bản sao của plasmit tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đa vào. Chỉ trong một số trờng hợp, lợng ADN plasmit trong tế bào A. tumefaciens đủ để cắt enzym hạn chế và điện di sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử thông thờng của Sambrook & đtg [197].
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành PCR. Đây là phơng pháp đơn giản cho phép khẳng định và xác định chính xác cấu trúc của plasmit tái tổ hợp đợc biến nạp vào A. tumefaciens. Giống nh các PCR thông thờng, hiệu quả phản ứng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: trình tự mồi, nồng độ Mg+, nhiệt độ và thời gian của các chu kỳ phản ứng Theo Walkerpeach … & Velten, cặp mồi để nhân CaMV35S-P và NOST chứng minh sự có mặt của plasmit tái tổ hợp trong Agrobacterium và tế bào thực vật chuyển gen là cặp mồi đợc sử dụng nhiều và cho hiệu quả rất cao [197].
CaMV35SP: 5’- TCTGTCACTTCATCAAAAGGACAG-3’
NOST: 5’- GAATCCTGTTGCCGTCTTG-3’
Với cặp mồi nhân C71S-P có sẵn, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn khởi động này ở cấu trúc gen mới thiết kế đợc sử dụng ADN khuôn là plasmit tái tổ hợp tách chiết từ tế bào A. tumefaciens. Kết quả PCR trên hình 3. 24 cho thấy, chúng tôi đã đa đợc plasmit tái tổ hợp pC1300-C71S-cryIA(c) vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp đợc chúng tôi lu giữ dùng làm nguyên liệu để chuyển vào cây trồng.
Nh vậy, chúng tôi đã nhận đợc các dòng vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 và LBA4404 có chứa plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c)/ pC1300- C71S-cryIA(c) dùng làm nguyên liệu để chuyển gen cry vào lúa.