3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.4.2 Tạo protein CryIA(c) tái tổ hợp trong vi khuẩn E col
Hệ thống biểu hiện gen nhờ vi khuẩn E. coli là hệ thống lý tởng đợc sử dụng để biểu hiện rất nhiều loại protein. E. coli dễ dàng đợc nuôi cấy và nhân lên trong môi trờng thông dụng.
Hình 3.27. Thiết kế vectơ biểu hiện pET21d-cryIA(c)
1. ADN λ/ EcoR I+Hind III 2. pET21d
3. pET12d-cryIA(c)
4. pET21d-cryIA(c)/ Nco I+BamH I 5. pET21d/ Nco I+BamH I
Một số phơng pháp truyền thống thờng đợc sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hoá protein tinh thể độc tố của Bt là phơng pháp điện di trên gel polyacrylamit và phơng pháp lai miễn dịch với kháng thể đa dòng kháng các loại protein tinh thể độc tố.
Theo những hớng nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vectơ pET21d-cryIA(c) vào tế bào E. coli chủng BL21(DE3) (chủng có khả năng biểu hiện cao) và biểu hiện protein tái tổ hợp trong môi trờng nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng 1mM IPTG. Sinh khối tế bào sau 3 giờ nuôi cấy đợc phá vỡ bằng siêu âm trong dung dịch lysozyme có chứa 0.1mM PMSF (phenyl metasulphonyl fluoride). Quá trình biểu hiện gen đợc xác định qua việc xuất hiện phân tử protein mới ở cặn tế bào trên gel điện di SDS-PAGE. Protein CryIA(c) tái tổ hợp đợc tinh chế bằng phơng pháp điện di đẩy ra khỏi gel trong túi thẩm tích nhờ điện trờng.
Các nghiên cứu cho thấy những phân tử protein độc tố do nhóm gen cryIA mã hoá thờng tồn tại ở dạng tiền độc tố và chứa tới hơn 80% trình tự tơng đồng. Tiền độc tố CryIA có kích thớc phân tử khoảng 130-140kDa và bao gồm hai phần: phần đầu N mang độc tính với kích thớc khoảng 60-70 kDa và phần đầu C kích thớc khoảng 60-70 kDa giàu cystein liên quan đến quá trình kết tinh của độc tố [107], [188]. Gen cryIA(c) chúng tôi sử dụng đã đợc cải biến cắt bớt phần gen mã hoá cho đầu C chỉ giữ lại phần gen mã hoá cho protein độc tố có kích thớc theo tính toán lý thuyết là 68,635 kDa (không kể methionin thờng bị loại bỏ sau dịch mã). Nh vậy, băng protein mới xuất hiện đậm nét trên gel SDS-PAGE có kích thớc khoảng 68 kDa tơng ứng với kích thớc của đoạn mang tính độc (cột 4, 6, hình 3.28).