3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.4.1 Thiết kế vectơ biểu hiện gen cryIA(c)
Nhóm gen cryI, mã hoá cho các protein có tính độc đối với côn trùng Bộ Cánh vảy, có phân tử lợng từ 130 - 140 kDa và bao gồm 8 nhóm phụ ký hiệu từ
cryIA đến cryIH. Trong đó cryIA đợc phân thành 3 nhóm nhỏ là cryIA(a), cryIA(b),
cryIA(c) [182]. Protein độc tố mã hoá bởi mỗi nhóm cryI đặc hiệu với những loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy nhất định. Nhóm CryIA với cấu trúc tơng đồng có phổ hoạt động trên các loài côn trùng khá giống nhau [107]. Các gen cry tự nhiên nh:
cryIA(a), cryIA(c), cryIA(b), cryIF và cryIIA đã đợc tạo dòng và biểu hiện trong E. coli, sử dụng nhiều hệ vectơ biểu hiện khác nhau để nghiên cứu cấu trúc phân tử của gen cry và hoạt tính kháng côn trùng của độc tố [48]. Trong khi đó, các gen cry đợc tổng hợp bằng con đờng hoá học cha đợc nghiên cứu biểu hiện trong E. coli.
Để có thể biểu hiện đợc gen cryIA(c) trong E. coli, trình tự nucleotit của gen trong quá trình thiết kế lắp ráp vào vectơ phải đảm bảo có mã khởi đầu (ATG) và mã kết thúc (UAA, UAG, UGA). Do đó, chúng tôi sử dụng hai enzym hạn chế là Nco I và BamH I để tạo mã khởi đầu và mã kết thúc trong gen cryIA(c) (hình 3.26).
Bớc đầu tiên, chúng tôi đã tiến hành tách chiết đoạn gen cryIA(c)-NOST kích thớc khoảng 2,1kb từ vectơ pGEM-4Z bằng cách xử lý với hai enzym hạn chế là
Nco I và BamH I. Sau đó tinh chế đoạn gen cryIA(c) sử dụng phơng pháp chiết bằng điện di trong túi thẩm tích và gắn vào vectơ biểu hiện pET21d đã đợc mở vòng trớc đó cũng bằng hai enzym này (hình 3.27). Tiếp theo, sản phẩm lai đợc biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α và đợc nuôi cấy trên môi trờng chứa Amp. Tách chiết plasmit các khuẩn lạc sau biến nạp và kiểm tra sơ bộ bằng điện di trên gel agaroza
0,8%. Các plasmit có kích thớc lớn hơn pET21d (mẫu đối chứng) đợc sử dụng để cắt kiểm tra bằng Nco I và BamH I.
Sản phẩm theo tính toán lý thuyết của plasmit tái tổ hợp có mang gen
cryIA(c) cắt bởi Nco I và BamH I là hai đoạn gen. Đoạn 1 có kích thớc ~ 5,4 kb - t- ơng ứng với kích thớc của vectơ pET21d và đoạn 2 có kích thớc ~2,1 kb - tơng ứng với kích thớc của gen cryIA(c).
Kết quả trên hình 3.27 cho thấy dòng plasmit chúng tôi dự đoán chứa gen
cryIA(c) sau khi cắt bằng Nco I và BamH I đã tạo ra các đoạn có kích thớc đúng
Hình 3.26. Kiểm tra nguyên liệu để thiết kế vectơ biểu hiện pET21d-cryIA(c)
1. ADN λ/ EcoR I + Hind III 2. pET21d
3. pGEM-4Z-cryIA(c) 4. pET21d/ Nco I + BamH I
theo tính toán lý thuyết: đoạn 1 dài khoảng 5,4 kb; đoạn 2 kích thớc khoảng 2,1 kb. Chúng tôi ký hiệu plasmit tái tổ hợp là pET21d-cryIA(c).