3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.3.3 Quy trình bảo quản giống vi khuẩn E coli và A tumefaciens tái tổ hợp
Nuôi cấy và lu giữ các chủng vi khuẩn là một trong những bớc quan trọng của kỹ thuật thiết kế vectơ chuyển gen thực vật. Các chủng vi khuẩn tái tổ hợp cần đợc kiểm tra định kỳ nhằm đảm bảo plasmit đợc duy trì và giảm khả năng nhiễm các loài vi sinh vật khác. Các chất kháng sinh thích hợp cần đợc bổ sung vào môi tr- ờng nuôi cấy nhằm tạo áp lực chọn lọc để loại bỏ các tế bào không mang vectơ trong quá trình phân chia. Căn cứ vào loại plasmit mà vi khuẩn mang, các chủng vi khuẩn mang các vectơ tái tổ hợp sau thiết kế đợc chúng tôi nuôi cấy trên các môi tr- ờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó giữ ở -750C phục vụ cho các thí nghiệm chuyển gen vào cây trồng. Đối với các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp, vì tốc độ sinh trởng chậm và chịu sự chọn lọc của nhiều loại kháng sinh, nên để phục hồi nhanh chóng các tế bào đang lu giữ ở -750C, chúng tôi thờng tiến hành làm mới lại giống bằng cách cấy lắc trên môi trờng lỏng trớc khi chọn lọc các khuẩn lạc đơn. Trong một số ít trờng hợp, nếu bớc phục hồi này không hiệu quả thì A. tumefaciens cần đợc cấy tiếp sang môi trờng lỏng và lắc trong khoảng 2 ngày ở 280C. Môi trờng nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi khuẩn tái tổ hợp đã tạo đợc tóm tắt trên bảng 3.13.
Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mới đợc chúng tôi chuyển giao cho Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học nhằm chuyển có
định hớng vào các giống cây trồng quan trọng của Việt Nam. Hàng loạt dòng lúa mang gen cry đã đợc kiểm tra sự có mặt của gen cry và trồng thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, trong khuôn khổ hợp tác với Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc BNN & PTNN), plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) cũng đã đợc các cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Sinh học chuyển vào một số giống ngô Việt Nam [Hợp đồng chuyển giao nguyên liệu, phụ lục 1]. Các dòng ngô tái tổ hợp này đang đợc kiểm tra, tái sinh thành cây hoàn chỉnh và nghiên cứu khả năng kháng sâu hại.
Bảng 3.13. Môi trờng nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi khuẩn mang các plasmit tái tổ hợp
Chủng Môi trờng Nồng độ kháng sinh chọn lọc (μg/ ml)
Amp Km Cb Rf
DH5α
(pC1300- cryIA(c))/ (pC1300- C71S-cryIA(c))/
(pNOV- Ubi-cryIA(c))
LB + Km - 50 - -
HB101
(pC1300-Ubi-cryIA(c))
LB + Km - 50 - -
LBA4404
(pC1300-Ubi-cryIA(c))/ (pC1300-C71S-cryIA(c))
YEP + Km
+ Rf + Cb - 50 100 100
EHA105
(pC1300-Ubi-cryIA(c))/ (pC1300-C71S-cryIA(c))
YEP + Km - 50 - -