3.1 phân lập đoạn khởi động của gen m hoá sucroza synthazaãtừ giống lúa C71 từ giống lúa C71
Thông thờng, đoạn khởi động không có nguồn gốc thực vật không hoạt động hoặc hoạt động rất yếu trong cây trồng chuyển gen [194]. Do vậy, các đoạn khởi động đợc sử dụng nhiều trong thiết kế vectơ và các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng thờng phải có nguồn gốc từ thực vật, hoặc từ virut và vi khuẩn (có tơng tác với thực vật), nh Ubi-P tách từ cây ngô, CaMV35S-P tách từ virut khảm súp lơ... Đây chủ yếu là các đoạn khởi động cơ định có khả năng điều khiển biểu hiện gen ở rất nhiều mô và cơ quan khác nhau [47], [55], [56].
Gần đây, đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở cây lúa đặc biệt đợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng do khả năng điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu trong bó mạch (phloem) [206]. Ví dụ điển hình, Rao & đtg đã sử dụng đoạn khởi động này để điều khiển quá trình biểu hiện gen mã hoá lectin ở cây hoa điểm tuyết trong cây lúa cho hiệu quả diệt côn trùng rất cao [163]. Nhằm mục đích sử dụng đoạn khởi động này trong việc thiết kế các vectơ mang gen kháng sâu đục thân, kháng côn trùng hút nhựa thân lúa nh rầy nâu, rầy xanh... để chuyển vào các giống lúa Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71, CR203. Sau đó tạo dòng và đọc trình tự đoạn khởi động này từ giống lúa C71.
3.1.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn khởi động của gen mã
hoá sucroza ở cây lúa
Sucroza synthaza (EC 2.4.1.13) là một trong những enzym quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào. Chúng xúc tác cho phản ứng thuận nghịch: sucroza + UDP ↔ fructoza + UDP-glucoza. Nhờ quá trình chuyển hoá này, cơ chất UDP-glucoza đợc cung cấp cho quá trình tổng hợp tinh bột và
thành tế bào. Để tìm hiểu một số trình tự của gen mã hoá sucroza synthaza ở cây lúa, chúng tôi đã tra cứu trong các Ngân hàng gen quốc tế EMBL, GENBANK và DDBJ. Kết quả, ở cây lúa hiện nay ngời ta đã tìm ra đợc ba gen Rsuc1, Rsuc2, Rsuc3 cùng mã hoá sucroza synthaza [199], [206]. Nghiên cứu của Huang & đtg về mức độ biểu hiện của các gen này trong các mô nh : rễ, chồi, mô sẹo, hạt cho thấy gen Rsuc2 có tính đặc hiệu mô không cao, gen Rsuc3đặc hiệu cao ở hạt, chỉ có Rsuc1 đặc hiệu bó mạch, rễ, mầm [111].
Nhằm nghiên cứu và sử dụng đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza phục vụ cho việc chuyển gen đặc hiệu bó mạch vào cây lúa, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn khởi động này. Kích th ớc của gen Rsuc1 là 8167 bp, trong đó kích thớc của vùng 5’ tơng đối lớn, chiếm khoảng 3 kb [199]. Tuy nhiên, các vùng trình tự đặc biệt cần thiết cho chức năng điều khiển của đoạn khởi động thờng nằm ở gần với vùng khởi đầu phiên mã. Vùng nằm xa vị trí khởi đầu phiên mã (về phía bên trên của đoạn khởi động) thờng chứa một vài đoạn tăng cờng [133].
Thông thờng, một gen đặc hiệu thực vật bao gồm đủ các yếu tố điều khiển cần thiết nằm trong phạm vi 1 - 2 kb tính từ vị trí khởi đầu phiên mã về phía đầu 5’. Do vậy, trên cơ sở trình tự của gen Rsuc1 đã công bố, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn khởi động với kích thớc khoảng 2 kb. Trong đó, mồi 1 (SUC-S) kích thớc 31 bp, mồi 2 (SUC-B) kích thớc 34 bp. Đặc biệt ở trong trình tự của đoạn mồi SUC-B, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự của hai enzym hạn chế là Nco I và BamH I và trong trình tự đoạn mồi SUC-S, vị trí nhận biết enzym Sac I cũng đợc bổ sung vào nhằm chuẩn bị cho bớc thiết kế vectơ chứa đoạn khởi động sau này. Trình tự của cặp mồi nh sau:
SUC-S: 5’-GGAGCTCGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACC-3’ Sac I
SUC-B: 5’-GCCATGGATCCCATGACTCAATTTCAGGAACTGC-3’ BamH I
3.1.2 Phân lập đoạn khởi động của gen m hoá sucroza synthaza từã
ADN genom của giống lúa C71 và CR203
Tách chiết ADN genom là bớc khởi đầu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đến nay có khá nhiều phơng pháp tách chiết ADN tổng số hiệu quả từ mô thực vật đã đợc nghiên cứu, cải biến và ứng dụng tuỳ thuộc vào đối tợng và điều kiện nghiên cứu [38], [74], [150]. Để tách chiết ADN genom từ 2 giống lúa CR203 và C71, chúng tôi đã sử dụng phơng pháp CTAB (Cetylmethylammonium bromide) của Murray & Thompson [150].
Hạt hai giống lúa C71 và CR203 đợc bóc vỏ trấu, chọn lọc (hạt không đen, non, vỡ) và khử trùng bằng ethanol, nớc giaven 60%, nớc cất vô trùng, sau đó cấy trên môi trờng MS (Murashige-Skoog) từ 10 ngày đến 2 tuần, thu lá mạ, giữ ở -200C để tách chiết ADN. Khoảng 2 g lá lúa đợc nghiền bằng cối và chày sứ trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Nhằm hạn chế sự phân huỷ ADN, cối chày sứ cần đợc giữ lạnh -850C trớc khi tiến hành thí nghiệm. Sau khi nghiền, mẫu đợc hoà trong dung dịch đệm chiết CTAB (với các thành phần NaCl, Tris.Cl, EDTA, CTAB), ủ từ 40-60 phút ở 600C. Để đảm bảo protein và tạp chất bị loại khỏi mẫu, chúng tôi đã xử lý dịch chiết nhận đợc bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : isoamylalcohol (24 : 1). Sau khi kết tủa bằng bằng isopropanol trong đá từ 20 - 40 phút, rửa và xử lý mẫu, chúng tôi đã thu đợc ADN genom.
Độ sạch sản phẩm ADN genom đợc kiểm tra bằng phổ hấp thụ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 0,8 %. Hình 3.6 là kết quả điện di sản phẩm tách chiết ADN genom từ giống lúa CR203 và C71. Trong đó, cột 2, 4 là các mẫu ADN genom còn lẫn ARN; cột 3, 5 là hai mẫu ADN đã xử lý RNaza để loại ARN. ADN chiết đợc từ 2 giống lúa C71, CR203 đều khá sạch và không bị phân huỷ và không lẫn ARN. Kết quả kiểm tra trên máy đo quang phổ cũng cho thấy ADN genom tách chiết đợc có độ tinh sạch cao (A260/ 280 từ 1,67 - 1,91) và có thể sử dụng làm khuôn để nhân đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza. Nh vậy, sử dụng phơng pháp CTAB, quá trình tách chiết ADN vừa nhanh, ít tốn kém hoá chất và hiệu quả đạt đợc tơng đối cao.
Từ ADN genom của hai giống lúa, sử dụng cặp mồi SUC-S/ SUC-B và Taq ADN polymeraza, chúng tôi đã tiến hành PCR nhân đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza. Trong các thành phần tham gia PCR, nồng độ đoạn mồi có ảnh h- ởng rất lớn đến chất lợng phản ứng. Nồng độ mồi cao là một trong những nguyên nhân xảy ra sự gắn mồi không đặc hiệu, cơ sở xuất hiện những trình tự không mong muốn trong sản phẩm cuối cùng. Trong khi, nồng độ mồi không đủ sẽ làm giảm hiệu quả của phản ứng. Đối với ADN khuôn, lợng mẫu sử dụng để PCR cũng cần đ- ợc điều chỉnh thích hợp. Hiệu quả PCR có thể giảm nếu nồng độ ADN khuôn quá cao do protein và các chất có trong ADN khuôn ức chế hoạt động của ADN polymeraza [170]. Vì vậy, trong quá trình tiến hành phản ứng, chúng tôi đã điều
Hình 3.6. ADN genom của 2 giống lúa Việt Nam
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 2. ADN CR203 (+ARN)