Chơng 2 vật liệu và phơng pháp
2.2.8 Loại bỏ nhóm 5' photphat của vectơ
Nhằm tránh hiện tợng tự đóng vòng, vectơ sau khi cắt hoàn toàn bằng enzym hạn chế thờng đợc loại nhóm photphat ở đầu 5' theo các bớc: (1) Chiết bằng phenol : chloroform mẫu ADN plasmit (10 - 20 àg) và tủa bằng hai thể tích cồn tuyệt đối
trong 15 phút ở 00C; (2) Ly tâm thu ADN ở 40C, 12000 v/ p, 10 phút; (3) Hoà cặn ADN trong 90 àl 10 mM Tris.Cl (pH 8,3), điện di kiểm tra và giữ mẫu còn lại ở -20
0C; (4) Thêm 10 àl dung dịch đệm dùng cho CIP (enzym photphataza kiềm đợc tách từ ruột bê - calf intestinal alkaline phosphatase) cùng một lợng enzym CIP thích hợp và ủ ở điều kiện tơng ứng (Lợng enzym cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạn cắt ADN mang đầu dính hay đầu bằng); (5) Sau khi ủ, thêm SDS và EDTA (pH 8,0) vào mẫu đến nồng độ cuối cùng tơng ứng là 0,5 % và 5 mM, trộn đều và thêm proteinaza K 100 àg/ ml, ủ 30 phút ở 560C. Proteinaza K dùng để hoà tan và loại CIP d thừa giúp cho quá trình gắn ADN vào vectơ hiệu quả hơn. CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằng cách ủ 1 giờ ở 650C hoặc 750C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0); (6) Làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng, chiết ADN bằng phenol : chloroform, bổ sung 0,1 thể tích 3 M axetat Na pH 7,0 (nếu pH =5,2 nh thông thờng thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ của chúng lớn hơn 5 - 10 mM), trộn đều và thêm 2 lần thể tích cồn tuyệt đối, đảo đầu ống eppendorf và giữ 15 phút ở 00C; (7) Ly tâm 12000 v/ p, 10 phút, 40C thu ADN, rửa cặn bằng cồn 70% ở 40C, làm khô ADN và hoà trong TE (pH 7,6), giữ ở - 20 0C.