3. ADN CR203 (-ARN) 4 ADN C71 (+ARN)
3.2.1 Thiết kế Ti-plasmit tái tổ hợp chứa gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động Ubiquitin
của đoạn khởi động Ubiquitin
Nguồn gen cryIA cải biến và tổng hợp hoá học chúng tôi nhận đợc từ Trờng Đại học Tổng hợp Ottawa, Canada là nguyên liệu chính sử dụng để thiết kế các Ti- plasmit tái tổ hợp. Những lý do chính để chúng tôi sử dụng gen cry tổng hợp nhân tạo này: (1) gen cry có khả năng kháng côn trùng đặc hiệu với nồng độ độc tố thấp và không ảnh hởng đến môi trờng sinh thái; (2) thông thờng các gen cry tự nhiên có hiệu quả biểu hiện trong thực vật không cao [32]; (3) gen cry chúng tôi sử dụng đã đợc nhóm nghiên cứu của Altosaar cải biến dựa trên trình tự đã biết của gen cry
nhằm tăng cờng quá trình sinh tổng hợp ARN thông tin và protein: thay đổi tối đa các mã di truyền theo hớng tăng hàm lợng Guanin/ Xytonin, cắt bớt gen, chỉ biểu hiện vùng gen cry liên quan đến tính độc của protein…[67], [173]; (4) các nghiên cứu chuyển gen thực vật sử dụng gen cry tổng hợp hoá học đã đợc tối u hoá về mã di truyền đã làm tăng tính độc của protein tinh thể độc lên nhiều lần [52], [166], [173].
Sau khi thiết kế, các cấu trúc gen đợc chúng tôi chuyển vào tế bào vi khuẩn
E. coli, mục đích để nhân Ti-plasmit tái tổ hợp với lợng lớn phục vụ thí nghiệm chuyển các plasmit này vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.
Chủng E. coli chứa plasmit pGEM4Z mang nguồn gen cryIA(c) dài 1845 bp dới sự điều khiển của Ubi-P đợc nuôi cấy lắc trên môi trờng LB lỏng ở 370C. Môi tr- ờng chọn lọc có bổ sung thêm 50 àg/ ml Amp. Để thu nhận đợc toàn bộ kết cấu gen
cry (Ubi-cryIA(c)-NOST), đầu tiên chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN plasmit của chủng vi khuẩn này. Sau đó dựa trên kết quả của bản đồ enzym hạn chế, một l- ợng lớn ADN plasmit đã đợc xử lý bằng enzym Hind III tạo sản phẩm là hai băng kích thớc khoảng 4,1 kb và 2,7 kb. Trong đó, băng 2,7 kb tơng ứng với vectơ pGEM4Z, băng 4,1 kb chính là kết cấu gen Ubi-cryIA(c).
Hớng thiết kế vectơ này của chúng tôi cũng phù hợp với công bố gần đây nhất của Cheng & đtg khi nghiên cứu chuyển gen cry vào lúa thông qua A. tumefaciens. Trong công trình này, các tác giả cũng tiến hành lắp ráp Ubi-cryIA(b) và Ubi-cryIA(c) vào Ti-plasmit tại điểm cắt của enzym Hind III [52]. Toàn bộ kết cấu gen Ubi-cryIA(c) đợc chúng tôi thu hồi bằng phơng pháp điện di đẩy ra khỏi gel trong túi thẩm tích nhờ điện trờng và dùng làm nguyên liệu cho phản ứng gắn vào Ti-plasmit.
Ti-plasmit chúng tôi sử dụng để thiết kế vectơ mang kết cấu gen Ubi-
cryIA(c) là pCAMBIA1300 (hình 3.13). Vectơ này có kích thớc phân tử 8958 bp và đợc cải tiến với một số đặc tính: (1) Vùng MCS nằm gần đoạn biên phải có nguồn gốc từ vectơ pUC18 thuận lợi cho quá trình đa gen quan tâm vào vectơ; (2) Mang chỉ thị sàng lọc xanh trắng nhờ biểu hiện hoặc không biểu hiện β-galactosidaza; (3) Dễ dàng nhân trong E. coli với số lợng bản sao lớn; (4) Có thể sử dụng phơng pháp phối ba bố mẹ để chuyển vectơ này vào tế bào A. tumefaciens; (5) Nhờ sự có mặt của vùng rep và sta có nguồn gốc từ vectơ pVS1, pCAMBIA1300 có thể tồn tại trong tế bào A. tumefaciens trên môi trờng không chọn lọc [66]; (6) Mang gen kháng kanamycin dùng cho chọn lọc vi khuẩn và gen kháng hygromycin dùng cho chọn lọc thực vật.
Với các đặc tính trên, pCAMBIA1300 đợc sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào thực vật đặc biệt là lúa và một số cây trồng quan trọng khác.
Vectơ pCAMBIA1300 đợc gửi đến từ úc ở dạng thấm khô trên giấy lọc. Sau khi ngâm giấy lọc trong đệm TE, vectơ đợc biến nạp vào tế bào E. coli (chủng DH5α) theo phơng pháp sốc nhiệt với sự chọn lọc trên môi trờng LB có chứa 50 àg/ ml Km, 40 àg/ ml X-gal, 40 àg/ ml IPTG. Phơng pháp biến nạp này khá đơn giản nhng cho hiệu suất tơng đối cao nên rất phù hợp với điều kiện thí nghiệm ở nớc ta. Kết quả, trên đĩa môi trờng LB đã xuất hiện những khuẩn lạc màu xanh do pCAMBIA1300 mang gen lacZ mã hoá enzym β-galactosidaza. Trên môi trờng có IPTG - chất cảm ứng của β-galactosidaza và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D(-)- galactopyranosit (X-gal) - cơ chất của β-galactosidaza, X-gal sẽ bị β-galactosidaza (sản phẩm dịch mã của gen lacZ) xúc tác chuyển thành sản phẩm màu xanh [71]. Từ các khuẩn lạc sau biến nạp, chúng tôi đã tiến hành tách chiết, tinh chế Ti-plasmit và kiểm tra một số vị trí enzym hạn chế. Điện di đồ cho thấy ADN tách chiết đợc có độ tinh sạch rất cao, chất lợng đảm bảo cho các thao tác thiết kế vectơ cần thiết (hình 3.14).
Kết quả xử lý vectơ bằng Hind III là plasmit ở dạng mạch thẳng (cột 3, hình 3.14). Còn đối với Xho I, sản phẩm cắt là hai băng khoảng 8 kb và 1 kb. Băng có kích th- ớc 1 kb tơng ứng với độ dài của gen kháng hygromycin và băng kích thớc 8 kb tơng ứng với phần còn lại của vectơ (cột 4, hình 3.14). Vectơ pCAMBIA1300 sau đó cũng đợc xử lý một lợng lớn bằng Hind III, loại bỏ nhóm photphat và sử dụng làm vectơ.
Kết cấu gen Ubi-cryIA(c) (50 ng - 8àl) đợc gắn vào vectơ pCAMBIA1300 và biến nạp vào tế bào E. coli (chủng HB101). Chúng tôi chọn chủng E. coli chủ là HB101 (thay vì DH5α thông thờng) để chuẩn bị cho bớc đa plasmit tái tổ hợp vào A. tumefaciens tiếp theo. Trên môi trờng thạch LB chứa 50 àg/ ml Km, 40 àg/ ml X- gal, 40 àg/ ml IPTG, chúng tôi đã chọn lọc các dòng vi khuẩn có màu trắng. Màu trắng xuất hiện do gen lacZ bị bất hoạt khi đoạn ADN ngoại lai (trong trờng hợp này là kết cấu gen cry) chèn vào. Sau đó, chúng tôi đã tách chiết ADN plasmit từ các khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng bằng phơng pháp vi điều chế và tuyển chọn trên điện di gel agaroza 1%.
Phân tích bản đồ enzym hạn chế, chúng tôi nhận thấy, nếu kết cấu gen Ubi-
cryIA(c)-NOST đã gắn đợc vào vectơ pCAMBIA1300 thì khi xử lý plasmit tái tổ hợp và pGEM-4Z-Ubi-cryIA(c) ban đầu bằng các enzym Hind III và BamH I, sản phẩm sẽ là
Hình 3.14. Kiểm tra vectơ pCAMBIA1300 tinh sạch bằng phân tích enzym hạn chế
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 3. pCAMBIA1300/ Hind III
các đoạn ADN tơng đồng hoặc tơng ứng với toàn bộ kết cấu gen, hay tơng ứng với đoạn khởi động Ubiquitin, hoặc vùng mang mã của gen cry. Trên cơ sở này, chúng tôi đã kiểm tra cấu trúc của các plasmit có kích thớc lớn hơn bằng cách cắt đơn với enzym
Hind III, BamH I và cắt kép với Hind III + BamH I. Sau đó điện di đồng thời với mẫu plasmit pGEM-4Z-Ubi-cryIA(c) cũng cắt bằng các enzym này (hình 3.15).
Kết quả trên hình 3.15 cho thấy, các sản phẩm cắt enzym hạn chế của pGEM4Z-Ubi-cryIA(c) và Ti-plasmit tái tổ hợp có sự tơng đồng:
Trờng hợp cắt bởi Hind III, đều xuất hiện một băng có kích thớc khoảng 4,1 kb (cột 2, 3). Đây chính là kết cấu gen Ubi-cryIA(c).
Sản phẩm khi xử lý BamH I là một băng kích thớc khoảng 2 kb tơng ứng với đoạn khởi động Ubiquitin (cột 4, 5).
Hình 3.15. Kiểm tra cấu trúc của plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-cryIA(c)
1. ADN λ/ Hind III + EcoR I 2. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 3. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III 4. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ BamH I 5. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ BamH I
6. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ Hind III + BamH I 7. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III + BamH I
Hai băng tơng đồng khi cắt bởi Hind III và BamH I có kích thớc khoảng 2 kb và 2,1 kb (cột 6, 7).
Những kết quả trên khẳng định chúng tôi đã đa đợc kết cấu gen Ubi-
cryIA(c)-NOST vào Ti-plasmit và tạo đợc Ti-plasmit tái tổ hợp pC1300-Ubi-
cryIA(c) (hình 3.16) trong tế bào E. coli (chủng HB101). Dòng các tế bào E. coli
chứa pC1300-Ubi-cryIA(c) đợc chúng tôi bảo quản trong glycerol, ở -750C và sử dụng làm nguyên liệu để chuyển plasmit này vào A. tumefaciens.