: Chiều mũi tên chỉ hướng tra mẫu 1 phôi, bổ sung puromycin với nồng độ
2.3.3.8. Phương pháp khuếch đại ADN bằng phản ứng PCR
2.3.3.8.1. Phương pháp phá vỡ tế bào thu ADN
- Tế bào sau khi lấy từ các giếng nuôi cấy sẽ được li tâm thu cặn tế bào. - Tế bào trong các giếng được cho vào khoảng 10
- Để hỗn hợp tế bào trong TE vào nước ở 94oC trong khoảng 10 phút.
2.3.3.8.2. Phương pháp thu ADN từ tế bào hồng cầu gà
- Gà nuôi khoảng 10 ngày
- Mỗi lần tiến hành lấy máu gà bằng cách:
+ Người thứ nhất: bắt gà, giữ chân và mình gà, đặt lên bàn mổ, mở ngửa cánh gà ra.
+ Người thứ 2: dùng cồn lau vị trí tĩnh mạch cánh gà, dùng xi lanh 1ml đó trỏng bằng dung dịch chống đơng, đưa vào tĩnh mạch và hút từ từ, lấy khoảng 0,1 ml máu, chuyển vào ống eppendorf.
- Sau đó tiến hành li tâm với tốc độ 1200 vũng/phỳt, trong 15 phút - Loại bỏ dịch (huyết tương), thu cặn tế bào (hồng cầu)
- Bổ sung thêm 0,5 ml TE
- Sau đó sử dụng bộ kit để tách ADN.
2.3.3.8.3. Phương pháp thu ADN từ nội quan gà
- Gà con khoảng 1 tháng tuổi.
- Vô trùng gà trước khi mổ bằng cồn 700.
- Dùng kéo cắt bỏ lớp da dưới bụng gà rồi cắt xương ức để lộ nội tạng - Dùng panh gắp các nội tạng của từng con gà (gan, lách, ruột, phổi, tủy
xương, tụy…) để riêng vào các ống eppendorf có chứa dung dịch PBS (để riêng mỗi nội quan của từng con gà)
- Chuyển các nội quan sang các ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch TE buffer, dùng dụng cụ nghiền tế bào chuyên dụng nghiền nát các nội quan thành dung dịch đồng nhất.
- Sử dụng bộ kit để tách ADN
2.3.3.8.4. Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR
- Chúng tôi sử dụng kĩ thuật Multiplex PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho eGFP có chiều dài 18 bp và có trình tự như bảng 2.4 (mục 2.2.5). Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP.
- Bên cạnh việc khuếch đại gen mã hóa cho eGFP, chúng tôi cũng sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của gen ribosome 18S ở gà. Đây là đoạn gen rất bảo thủ, mục đích sử dụng cặp mồi này để chứng minh sự hiện diện của hệ gen gà trong mẫu thí nghiệm. Hai cặp mồi 18S cũng có chiều dài 18 bp và có trình tự ở bảng 2.5 (mục 2.2.5).
Thành phần phản ứng PCR như sau:
Thành phần Thể tích
H2O
dNTP (10mM) Buffer 10X for Taq Taq (1 unit/àl)
eGFP (primer)(10 àM) àM) 18S (primer)(10 àM)
Template
∑
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR như sau:
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 94 7 phút
2 94 30 giây
3 59 1 phút
4 72 30 giây