- Vỏ trứng được ngâm bảo quản trong cồn 70o
B: Tách miếng vỏ đó vụi và nhỏ 1 giọt PBS lên C: Tách lớp màng vỏ trong buồng thao tác vô trùng
C: Tách lớp màng vỏ trong buồng thao tác vô trùng D: Vi tiêm 2 àl ADN vào xoang dưới phôi
2.3.3.3. Phương pháp ấp trứng
- Trứng 0 giờ ấp (cung cấp bởi Trung tâm gia cầm Thụy Phương) sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon với tỉ lệ 17,5g KMnO4 : 35ml focmon/1m3 thể tích.
- Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên. - Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau:
+ Nhiệt độ: 37,8 o
C.
+ Đảo trứng: 2h/lần. 10-12 lần/ngày.
+ Thơng thống: vận tốc gió 77 cm/giõy; tốc độ quạt: 300 vũng/phỳt.
2.3.3.4. Phương pháp kiểm tra tỉ lệ phôi
Sau 7 ngày ấp, soi trứng trờn đốn chuyên dụng để kiểm tra sự phát triển của phơi. Nếu nhìn thấy các mạch máu bên dưới lớp vỏ trứng thì chứng tỏ phơi phát triển bình thường; nếu khơng thấy các mạch máu thì trứng đó khơng có phơi.
Hình 2.12: Phương pháp kiểm tra sự phát triển của phôi (A);
Trứng cú phụi phát triển bình thường (B)
Tỉ lệ phơi xác định theo cơng thức:
Tỉ lệ phôi (%) = Số trứng cú phôi / tổng số trứng * 100%
2.3.3.5. Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi
2.3.3.5.1. Tách tế bào phôi 7 ngày ấp
Mỗi đợt thí nghiệm chuyển gen, chúng tơi lựa chọn 5 phơi phát triển bình thường để tiến hành phân lập và nuôi cấy tế bào in vitro từng phôi riêng rẽ.
A
- Trứng giai đoạn 7 ngày ấp cú phụi phát triển bình thường được khử trùng bằng cách lau cồn 70 độ.
- Dùng kéo đập vỡ và cắt lớp vỏ đá vôi ở đầu tù của trứng.
- Dùng panh và kéo lấy phôi ra khỏi trứng và cho vào đĩa petri đựng dung dịch muối sinh lý.
- Phôi được rửa sạch 2, 3 lần bằng dung dịch sinh lý cho sạch máu, lịng trắng và lịng đỏ trứng.
Hình 2.13: Phơi gà 7 ngày ấp
- Chúng tôi chuyển phôi vào buồng thao tác vô trùng và rửa bằng PBS khoảng 2 lần.
- Sau khi rửa sạch bằng PBS, phôi được chuyển sang ống eppendorf (mỗi phôi được chuyển vào 1 ống eppendorf riờng), dựng kộo bấm cắt nhỏ trong 0,5ml trypsin 0.25% trong 2 phút.
- Chúng tôi dùng khoảng 1 ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin. - Huyền phù tế bào được lọc bằng gạc, loại bỏ cặn to, thu dịch tế bào và
dùng để nuôi cấy.
2.3.3.5.2. Phương pháp ni cấy đơn dịng
- Tiến hành đếm số lượng tế bào trong dịch huyền phù tế bào để khi ni cấy có mật độ tế bào thích hợp.
- Hút dịch huyền phù tế bào, mỗi phôi được chia vào 4 giếng đã có sẵn 0,5 ml mơi trường nuôi cấy.
- Sau 24 giờ nuôi cấy, chúng tôi tiến hành kiểm tra và thay môi trường cho các giếng nuôi cấy.
- Sau 72 giờ nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển và tiếp tục nuôi cấy in vitro cho tới khi mật độ tế bào trong giếng nuôi cấy đạt > 90% và tiến hành sàng lọc puromycin để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.
2.3.3.5.3. Phương pháp cấy chuyển nguyên bào sợi
Khi mật độ tế bào chiếm trên 90% diện tích bề mặt giếng ni, đảm bảo cho tế bào tăng sinh tốt, ta tiến hành cấy truyền.
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy. - Rửa 1 lần bằng PBS.
- Bổ sung khoảng 0,5ml trypsin 0,25% đồng thời vỗ nhẹ thành giếng để cho các tế bào bong ra, pipetting để đánh tan các cụm tế bào.
- Bất hoạt trypsin bằng môi trường nuôi cấy với lượng gấp đôi. - Ly tâm ở 1500 vũng/phỳt trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch nổi và đánh tan khối tế bào thu được và chuyển huyền phù sang các giếng nuôi cấy mới.
2.3.3.6. Phương pháp sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin puromycin
- Puromycin gốc có nồng độ 10 mg/ml được pha loãng thành dãy nồng độ 100 g/ml, 200 g/ml và 300 g/ml. Mỗi đợt thí nghiệm, các giếng ni cấy tế bào được bố trí như trên sơ đồ hình 2.14.
- Sau 24 giờ - 48 giờ nuôi cấy, khi mật độ tế bào đạt khoảng 0,5x106 tế bào/giếng nuôi cấy, chúng tôi tiến hành xử lý bằng puromycin trên 2 lụ: lơ TN (phụi có chuyển gen) và lơ ĐC (không chuyển gen) với nồng độ puromycin
lần lượt là 1 g/ml, 2 g/ml, và 3 g/ml puromycin và 1 giếng không bổ sung puromycin. Do môi trường nuôi cấy tế bào trong giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng là 1 ml/giếng. Vì thế trong các giếng cần bổ sung puromycin vào môi trường nuôi cấy nồng độ 1 μg/ml, chúng tôi lấy 10 μl của puromycin nồng độ 100 μg/ml cho vào mỗi giếng, trong các giếng cần bổ sung puromycin vào môi trường nuôi cấy nồng độ 2 μg/ml, chúng tôi lấy 10 μl của puromycin nồng độ 200 μg/ml cho vào mỗi giếng và trong các giếng cần bổ sung puromycin vào môi trường nuôi cấy nồng độ 3 μg/ml, chúng tôi lấy 10 μl puromycin nồng độ 300 μg/ml cho vào mỗi giếng.
- Sau khi bổ sung puromycin vào các giếng nuôi cấy, lắc nhẹ để puromycin hồ lẫn với mơi trường và tiếp tục nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
Hình 2.14: Sơ đồ thí nghiệm sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng
puromycin theo các nồng độ khác nhau