11 Kháng sinh
2.3.2.1. Các phương pháp sử dụng trong quy trình chuyển gen qua tinh trùng
2.3.2.1.1. Phương pháp mỏt-xa tạo phản xạ xuất tinh ở gà trống
Trước khi huấn luyện 3 - 5 ngày, chọn 5 con trống khỏe mạnh, khơng có dị tật, khơng có tính hăng, đang trong thời kỳ thành thục nuôi tách khỏi gà mái, nhốt trên lồng tầng hoặc nuụi trờn nền, nhốt chung hoặc nhốt cá thể tùy điều kiện chuồng trại nhưng với yêu cầu là không cho gà đá nhau. Gà trống nên được làm quen với người lấy tinh qua màu áo quần và thái độ tiếp xúc ơn hịa, nhẹ nhàng. Đồng thời cắt bỏ bớt phần lông che phủ lỗ huyệt. Đúng 14h chiều mỗi ngày sẽ tiến hành mát xa tạo phản xạ xuất tinh cho những con gà trống đó.
Nhẹ nhàng bắt gà trống và kẹp vào nỏch trỏi (nếu thuận tay phải), cho đi gà hướng ra phía trước. Luồn bàn tay trái dưới lườn gà và cố định 2 đùi gà (gà không quẫy nhưng vẫn thoải mái và 2 chân gà được thả lỏng). Dùng bàn tay phải vuốt lên lưng gà xi về phía phao câu nhằm kích thích phản xạ xuất tinh. Thực hiện động tác này trong khoảng 5 phỳt/con ở lần đầu huấn luyện đầu tiên.
Trong các lần tiếp theo, động tác đó được giảm thời gian và khi đuôi gà cong lên chứng tỏ gà trống đó cú phản xạ xuất tinh.
Cần thực hiện liên tục hàng ngày cho tới khi các con gà trống có phản xạ xuất tinh (khoảng 7 ngày) thì tiến hành lấy tinh trùng và TTNT.
2.3.2.1.2. Phương pháp lấy tinh trùng gà
- Người thứ nhất: thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà trống. Khi gà trống cong đuôi lên, chứng tỏ gà đáp ứng sự kích thích và chuẩn bị xuất tinh. Lúc đó dùng ngón cái và ngón trỏ (tay phải) bóp nhẹ vào vùng lỗ huyệt và hơi ấn vào bụng dưới lỗ huyệt để tăng thêm kích thích.
- Người thứ hai: dùng một tay vén ngược đuôi gà lên để lộ vùng huyệt và đỡ vướng bàn tay phải của người thứ nhất. Vào thời điểm này, gà trống sẽ phóng tinh dịch màu trắng ra ngoài, người thứ 2 kịp thời dùng dụng cụ để hứng tinh dịch (hình 2.5).
Hình 2.5: Phương pháp lấy tinh trùng gà
Sự phối hợp giữa hai người phải nhịp nhàng và ăn khớp nhau, nếu không sẽ làm gà bị ức chế phản xạ xuất tinh hoặc tinh dịch phóng ra ngồi dụng cụ hứng tinh. Cũng cần chú ý một số gà thải phõn cựng lỳc với tinh dịch (nhất là những gà được ăn trước khi lấy tinh), vì vậy cần cẩn thận tránh việc hứng phân vào dụng cụ đựng tinh dịch.
2.3.2.1.3. Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng
- Pha loãng tinh dịch: Dùng ống trộn hồng cầu hút tinh dịch nguyên đến vạch 0.5, sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% (để giết chết tinh trùng) đến
vạch 101. Trong quá trình hút tinh dịch và dung dịch NaCl chú ý không để hiện tượng sủi bọt trong ống.
- Dùng ngón tay cái và ngón giữa bịt hai đầu ống trộn, lắc nhẹ, đều trong 2 - 3 phút để trộn đều dung dịch
- Bỏ 3 - 4 giọt đầu, rồi nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu (hình 2.6), đậy lamen.
Hình 2.6: Buồng đếm hồng cầu Neubauer
(Gồm 15 hàng và 15 cột, tạo thành 225 ô vuông lớn, trong đó có 25 ơ vng lớn ở trung tâm lại được chia nhỏ, mỗi ơ vng lớn có 16 ơ vng nhỏ; mỗi ơ vng nhỏ có chiều sâu 1/10 mm; rộng 1/20mm) [64].
- Đếm số lượng tinh trùng: Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, quan sát ở vật kính 10X để thấy được ơ buồng đếm, sau đó chuyển sang vật kớnh lờn 40X và tiến hành đếm. Đếm theo quy tắc (hình 2.7):
+ Đếm 5 ô vuông lớn (4 ô ở 4 góc và ơ ở giữa). + Đếm từ trái sang phải và từ trên xuống dưới.
+ Những tinh trùng nằm trờn mộp ranh giới buồng đếm thì khơng đếm. Đếm những tinh trùng ở trong 1 ô và những tinh trùng nằm trên và bên phải của ô đếm, đếm mỗi mẫu 2 lần để lấy sai số.
Hình 2.7: Cách đếm tế bào trong buồng đếm
Đếm 4 ơ vng ở bốn góc và 1 ơ ở giữa
Chiều mũi tên chỉ đếm từ trên xuống dưới và từ trái qua phải.
+ Kết quả số lượng tế bào được tính theo cơng thức:
C = 80 000 . 000 . 4 200x x n = n x 10 x 106
Trong đó: C: Nồng độ tinh trùng (tinh trựng/ml)
n: Số lượng tinh trùng có trong 80 ơ vng nhỏ 200: Số lần pha loãng tinh dịch
4.000 000: Thể tích 1 ơ vng nhỏ: 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm3 = 1/4000000 cm3.(ml)
80: Tổng số ô vuông nhỏ đã đếm.
2.3.2.1.4. Phương pháp chuyển gen bằng LipofectaminTM
2000 vào tinh trùng
* Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN-liposome): đóng gói vector transposon sleeping beauty pT2/BH-CVpf-SB11 vào LipofectaminTM2000.
(Quá trình này được thực hiện song song với bước lấy tinh dịch)
- Lấy 1 ống eppendorf trên 500 àl mơi trường DMEM khơng có FBS. - Lắc nhẹ LipofectaminTM2000 trước khi sử dụng, sau đó lấy 20 àl nhỏ từ
từ vào chính giữa bề mặt mơi trường trong ống eppendorf đã chuẩn bị ở trên, không lắc, không trộn. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
- Lấy 8 àg AND (tùy vào nồng độ AND quy ra thể tích lấy) cho vào ống eppendorf trên, không dùng pipet hỳt lờn hỳt xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng 20 phút.
- Sau 20 phút trộn đều và sử dụng cho TTNT.
* Phương pháp chuyển phức hợp lipoplex vào tinh trùng
- Lấy tinh dịch thu được, khoảng 1-1,5 ml, pha lỗng với 4 ml mơi trường DMEM khơng có FBS (tỉ lệ pha lỗng thích hợp nhất của tinh dịch và môi trường là 1:3)
- Trộn đều phức hợp lipoplex với tinh dịch vừa thu được (tổng khoảng 6ml), ủ 20 - 50 phút rồi tiến hành TTNT cho gà mái.
2.3.2.1.5. Phương pháp thụ tinh nhân tạo cho gà mái
Gà mái được lựa chọn đạt tiêu chuẩn giống, khỏe mạnh, khơng có khuyết tật, sức đẻ tốt và được tách trống trước ít nhất 20 ngày trước khi TTNT. TTNT cho gà cần tiến hành vào khoảng 14 - 16 giờ trong ngày vì buổi sáng đường sinh dục gà mái thường có trứng, ngăn cản sự di chuyển của tinh trùng.
Hình 2.8: Phương pháp TTNT cho gà mái
- Người thứ nhất: giữ gà mái bằng tay trái qua phần ngực, chúc đầu gà xuống dưới, tay phải vộn đuụi lờn để ngón cái ở trên và ngón trỏ ở dưới lỗ huyệt, ấn nhẹ vào vùng xung quanh lỗ huyệt. Cùng thời điểm đú, dựng ngón cái và ngón trỏ búp vựng lỗ huyệt, kết quả là lỗ huyệt lộn ra ngoài. - Người thứ hai: lấy tinh dịch thu được vào xy lanh chuyên dụng và đưa
vào đường sinh dục gà mái. Bơm tinh dịch vào sau đó rút xy lanh ra, cùng lúc đó người thứ nhất thả tay khỏi lỗ huyệt, lỗ huyệt gà trở về trạng thái bình thường.
TTNT được tiến hành 3 lần/tuần và thu trứng hàng ngày sau khi TTNT.
2.3.2.2. Các phương pháp sử dụng trong quy trình chuyển gen bằng vi tiêm AND vào phôi gà 0 giờ ấp