: Chiều mũi tên chỉ hướng tra mẫu 1 phôi, bổ sung puromycin với nồng độ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA NỒNG ĐỘ TINH TRÙNG
3.2.2. Kết quả nuôi cấy in vitro tế bào phân lập từ phôi gà 7 ngày ấp
Nguyên bào sợi sau khi phân lập từ phôi 7 ngày ấp được chuyển vào các giếng nuôi cấy với lượng tế bào ban đầu được cấy vào mỗi giếng khoảng 0,3x106 tế bào/giếng. Môi trường được dùng để ni cấy dịng ngun bào sợi phôi gà: DMEM + 10% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 àg/ml streptomycin hoặc Optimen + 5% FBS + 100U/ml Penicillin, 100 àg/ml streptomycin. Sau 24h nuôi cấy, nguyên bào sợi bám xuống đáy giếng và có hình dạng đặc trưng: tế bào có hình thn nhọn hai đầu, phân nhánh. 24h sau nuôi cấy in vitro, tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi và thay môi trường. Sau 24h,mật
độ tế bào chiếm trên 70% bề mặt giếng. Sau 72h nuôi cấy (tế bào chiếm khoảng 90 % bề mặt giếng nuôi cấy), tiến hành cấy chuyển với tỉ lệ 1:2. Sau lần cấy chuyển đầu tiên nguyên bào sợi gà vẫn tăng sinh nhanh chóng, tế bào vẫn giữ được hình dạng ổn định. Số lượng tế bào trong mỗi giếng nuôi cấy trước khi cấy chuyển đều được kiểm tra bằng buồng đếm hồng cầu. Mỗi giếng nuôi cấy của cả lô TN và ĐC đều được cấy số lượng tế bào tương tự nhau, khoảng 0,3x106
tế bào/giếng.
Sau 48 giờ sau khi cấy chuyển, tế bào bắt đầu được xử lý bằng puromycin (lúc này, mỗi giếng ni cấy có mật độ khoảng 0,3x106
- 0,5x106 tế bào/giếng) (hình 3.1).
Hình 3.1: Tế bào phơi gà 7 ngày ấp trước khi sàng lọc bằng puromycin
(1: tế bào sống; 2: tế bào chết)
Mỗi đợt thí nghiệm được tiến hành trên 6 phơi gồm 1 phôi đối chứng (ĐC) và 5 phôi TN, mỗi phụi cú 4 giếng gồm 1 giếng không bổ sung puromycin, và 3 giếng cịn lại có nồng độ puromycin là: 1μg/ml, 2 μg/ml, 3 μg/ml. Lần lượt tế bào trong từng giếng của cỏc lụ được quan sát dưới kính hiển vi và đếm số lượng tế bào sau 24h. Bằng mắt thường ta cũng nhận thấy sự khác nhau về màu sắc của mơi trường ở các giếng có nồng độ puromycin
2
khác nhau. Ở các giếng khơng bổ sung puromycin, môi trường bị mất màu do trong mơi trường có chất chỉ thị màu hồng phenol khi tế bào tăng sinh mạnh đã làm thay đổi độ pH môi trường sang axit khiến môi trường đổi màu. Ở các giếng bổ sung các nồng độ puromycin khác nhau có sự khác nhau.