1.Trình tự của primer
Đối với genome của eukaryote người ta thường dùng các primerdài khoảng 18 nucleotide trở
lên. Tuy nhiên, cũngtùy từng trường hợp,có những primer của các chỉ thị phân tử ngẫu nhiên như
RAPD1 rất ngắn (10-16 mer) hoặc STS2 cần primer dài hơn (20-24 mer).Nói chung, genomic DNA khônghoàntoànlàmộttrình tựngẫu nhiênmà nó còn mang đặctínhcủacáchọgen, những nhân tố có tính lặplại (sựlặp đoạn đơn giản hay phứctạp).Tùy theoloài sinh vậtvà tùy theocách thể hiệncủa
trình tựDNA khuôn mẫu, người tasẽthiết kế trình tự của primervà đối chiếu cẩn thậnnóvới sốliệu
lưu trữtrước đây nhằm loại trừ các saisót về kỹthuật. Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm trong computerđểthiết kế các primerthích hợp cho từngmục tiêu nghiên cứuvà có thể giúp loạibỏ các cặp primer được thiết kếkhông tối ưu.
Khi thiết kếprimer cầnchú ýmột số điểm như sau: Cốgắngchọntrình tựprimercó khoảng 50% GC.Tránh G vàC ở đầu 3’ của primervì nó cóthể làm tăng cơ hộitạo ra hiện tượng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau).Tránh chọn các vùngcó trình tự tương đồngđể hạn chế các primer tự
gắn với nhau.Tínhtoán nhiệt độ nóng chảy (Tm)của primer với tổng số 4oC cho GCvà2oC cho AT,
sau đótrừ đi 5oC từ giá trị nàyvà đây chínhlànhiệt độ ủ(Ta)của primer.Nói chung, nhiệt độ ủ có giá trịthấp hơn nhiệt độ nóng chảy của primer. Sự khác nhau từ4-6oC giữa Tm primervà Ta dường như
khôngảnh hưởngđến hiệu suấtcủa PCR.
2. Nhiệt độ củaquá trìnhủ
Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó đó 1/2 số primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứngdụng trong trường hợp primercó khoảng 20 oligonucleotide:
Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T)– 5oC (1)
Tuy nhiên, công thứcnày chỉ có tính tương đối, bằng kinh nghiệm nghiên cứu chúng ta mớicó
thể cósố liệu đúng vềnhiệt độchoquá trìnhủ. Số basecủa primercàngítthìnhiệt độ nàycàng thấp
3. Magnesium
Nồng độ của Mg2+ (được cung cấp dướidạng MgCl2)cóthể ảnh hưởng đến nhiệt độbiến tính DNA khuôn mẫu,quá trìnhủ của primer,tính đặc hiệu củasản phẩm PCR,hoạttínhcủa Taq polvà độ chínhxác của kếtquả. Nồng độ thích hợpcủa Mg2+ là từ0,5-2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số đãcho. Nồng độMg2+cao sẽ làm cho phân tử DNA sợi đôi ổn định hơn và ngăn ngừa được sựbiến chấthoàntoàn (mởxoắnđể giảiphóng sợi đơn củasản phẩm PCR trong mỗi chukỳ)làm cho kếtquả
PCRnghèo đi. Mặtkhác,nó cònlàm cho hiện tượng bắt cặp giả(tại những vị trí không tương đồng)
ổn định hơn dẫnđến xuất hiện nhữngsản phẩm PCR không đặc hiệu với số lượngkhálớn. Ngượclại, nếu nồng độMg2+quáthấpsẽ ảnh hưởng xấu đếnquá trình tổng hợp DNA (Mg2+ đóng vaitròlàmột co-factor của Taq pol). Do đó, cần phảixác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đạivà tính đặc hiệu củasản phẩm PCR.
4.Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs)
Dungdịch stock của các dNTP phảicópH 7, nồng độthườngdùnglà10 mM (2,5 mM mỗiloại)
được bảo quản ở -20oC. Hàm lượng của các dNTP trong khoảng 20-200 M cho kết quả ổn định,
chínhxác và đặc hiệu. Bốnloại dNTP được sử dụng cầncónồng độ tương đương nhau để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai (misincorporation)mãdi truyềnnào đó.
5. Enzyme Taq pol
Nồng độTaq polthích hợp là từ1-2,5 unit cho 100 L dungdịch phản ứng. Thông thường có
thể sử dụng 0,5 unit/25L. Nếu nồng độTaq polquá cao,cóthểxuất hiện cácsản phẩm PCR không
đặc hiệu và làm sai lệch kếtquả. Nếu nồng độTaq polquáthấp,sẽ không đủlượng enzymeđể xúctác
tạo rasản phẩm PCR mong muốn.
6.Đệm ổn địnhhoạt độngcủa Taq pol
Những chất ổn định Taq pol được sử dụng là gelatin và Triston X-100 trong đệm bảo quản enzyme. Nồng độthườngdùnglà0,01% gelatinvà0,1% (v/v) Triston X-100.
7. Nồng độ các primer
Trong hầu hếtcác ứngdụngcủa PCR, hai primer FvàRđều phảicónồng độ bằng nhau. Nồng
độcuốicùngcủa mỗi primerlà0,1M,tương đương với 2,5 pmol (16,25 ngcủa 20-mer) trong 25L dungdịchphảnứng. Sử dụng nồng độprimer cao không cần thiếtvàthườngtạo ra bất lợi,vì quáthừa primersẽ cóhiện tượng primer-dimersvàhiện tượng gắn primer nhầmvị trítrên khuôn mẫu.
8. Nồng độDNA khuôn mẫu
PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong
thành phầnphảnứng (bao gồm primer)cónồng độcao trong khi DNA khuôn mẫulạicónồng độthấp
thì giai đoạn sànglọccủa PCRsẽtrởnênkhó khăn hơn,vìtần suấtđểprimervàDNA khuôn mẫu gặp nhaugiảmrõrệt, trong khi sựtiếpxúc giữa primer vàprimerlại tăng lên gây ra hiện tương primer-
dimers trong giai đoạn khuếch đại. Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu được sử dụng trong
khoảng từ 10-100 ng/25L dung dịch phản ứng.
9.Tỷlệgiữa primervàDNA khuôn mẫu
Một trong những yếu tốquantrọng nhấtcủa PCRlà tỷlệtối ưu giữa primervàDNA khuôn mẫu. Nếutỷlệ nàyquácaothìhiện tượng primer-dimerssẽxuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNAquá loãng. Nếutỷlệ nàyquáthấp kếtquả sản phẩm PCRsẽkhông nhiều. Trong hầu hếtcác trường hợpáp
dụng PCR, người tađềudùng nồng độprimer khôngquá0,5M (12,5 pmol/25L)và tínhtoán nồng
độDNA khuôn mẫuđể tránh hiện tượng primer-dimers.
10. Khởi động nóng PCR
Khởi độngnóng PCR (“host-start” PCR)là phương pháp sản xuấtcácsản phẩm PCRsạch hơn. DNA khuôn mẫuvà primer được trộn với nhauvà giữ ởnhiệt độtrên ngưỡngcủa liên kết không đặc hiệu giữa primervàkhuôn mẫu. Tấtcả cácthành phầncủa PCR được bổsung trướcngoại trừmột chất then chốt (thườnglà Taq pol).Chỉtrước khi đi vào chu kỳkhuếch đại,thành phần chưa cómới được bổ sungđể chophép phảnứngxảy ra ởnhiệt độ cao hơn. Do khôngcóhiện tượng lai không đặc hiệu của primer với khuôn mẫu, nên các băng DNA được khuếch đại trở nên sáng hơn, các đoạn primer không có cơ hộiđể gắn với nhau. Kỹthuật này được tiến hành bằng cách làm lạnhcác tube trên đá
tuyết (ice bath) trong khi bổ sung hỗn hợp thành phần của PCR. Sau đó, đặt tube trong máy PCR đã được làm nóng ngay trước khi bổ sungthành phần cuốicùng. Dưới đây là ví dụ minh họa cho khởi động nóng PCR.
10.1. Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào E-tube loại 0,5 mL và trộn đều các thành phần sau:
Đệm 10× PCR 4,5L
Hỗn hợp4 dNTP (2,5 mM mỗiloại) 4L Primer-F (10 pmol/L) 2,5L Primer-R (10 pmol/L) 2,5L Thêm H2O tới 40L
10.2. Chuẩn bị dung dịch phaloãngcủa Taq pol:
Đệm ×10 2L
Taq pol (5 units/L) 1L Thêm H2O tới 20L
10.3. Bổ sung 5L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40L dung dịch của master mix tube.
10.4. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heat block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt theo
- Start program
- “Hot start”: Khoảng 80oC/10 giây «pause»
- Bổsung 2L/1 tube dungdịch phaloãngcủa Taq pol. - Restart
- 94oC/5 phút
- Thực hiện 30 chukỳ: 94oC/30 giây, 54oC/30 phútvà72oC/1 phút. - 72oC/10 phút
- Giữ sản phẩm PCR ở 4oC
- Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR
- Nếu chưa chạy điện dithì bảoquảnsản phẩm PCR ở-20oC