Các đoạn DNA thu được từ phảnứng cắthạn chế được gắn đồng hóa trịin vitro vào vectortạo
thườnglà cùng với enzyme được dùngđểcắt DNA nguồn, nhằm tạo các đầu kếtdính bổ trợcho các
đầucủacác đoạn chèn DNA. Một đôi khi, vectorvàDNA nguồn được cắt với tổhợp hai enzymekhác nhauđể ngăn cản mỗiloại phân tửtự gắnlại. Sựtự táitạo lạivòngcủa vectorcũngcóthể giảm thiểu bằngcách xử lývới enzyme alkaline phosphataseđể loạinhóm 5’ phosphate khỏicác đầucủa vector.
Một số lượng lớncác vectortạodòng đượcphát triển cho việc xây dựngcác thư viện DNA,chọn lựa vectornào phụthuộc vào phạm vi kích thướccủa các đoạn DNA được tạodòng,và các ứngdụng tiếp theo.
1.Các plasmid vector
Các plasmidlà các phân tử DNA mạch vòng đóng cộng hóa trị, siêu xoắn vàcó kích thước vài kilobase (chương 4). Mặc dù các plasmid xuất hiện tự nhiên, chủ yếu ở vi khuẩn, nhưng những plasmiddùng trong xây dựng các thư viện DNA thường được thiết kế có chủ định với các cấu trúc nhântạo.Các vectortạodòngnày chứacácvị trínhận biết đơn cho một enzymehạn chế mà tại đó các DNAngoại laicóthể được chèn vào (insertion).Các vị trícho nhiều enzyme khác nhaucó thể được tập hợplại trong vùngtạodòng (multiple cloning sites) hoặc vùng đa nối (polylinker).
Các plasmid mang bổ sung một hoặc nhiều gen chỉ thị(marker gene),như các genkhángkháng sinh, chophép chỉ có các tế bào chứa plasmid sinh trưởng trên môi trường chọn lọc, và các gen cho
enzyme như β-galactosidase chophépcác phân tử tái tổhợp chứa đoạn chèn DNA được phân biệt với
các thểkhôngtái tổhợp.
Nhược điểmcủacác plasmid được dùnglàmcác vectortạo dònglà khả năng chứacủachúngbị
giớihạnchỉ thích hợp với những đoạn DNAngoại laicó kích thướcnhỏ vài kilobase (kb)vàhiệu suất biếnnạpcủachúngvào tế bào vậtchủ tương đối thấp.
2.Các bacteriophageλ vector
Các bacteriophagelà các virus xâm nhiễmvào vi khuẩn. Genomecủa chúngcóthể làDNA sợi
đôi mạch vòng hoặc mạch thẳng, và được bọc bằng vỏ proteinlàm trung gian cho sự xâm nhập của
chúngvào tế bào vậtchủ.
Bacteriophageλ làmột trongcác vectortạodòng có nguồn gốc virus thông dụng nhất đượcdùng trong xây dựng thư viện. Genomecủa nóbao gồm một phân tửDNA sợi đôi mạch thẳng dài khoảng
50 kb, phân tử này xâm nhiễmvào E. colivà tạovòng bằngcáchghépcác đầudính (xem chương 4). Trong chukỳsinh tan (lytic cycle),các phân tử dạng vòngcủa λgenome sẽ được sao chépvà sau đó được cắtở vị trí đặc biệt (vị trícos) để tạo racác λmonomersẽ đónggói trongcác đầu proteinhoàn
chỉnh. Cũng có khi phageλ không đi vào chu kỳ tan, mà chuyển sang giai đoạn tiềm tan (lysogenic), trong suốt giai đoạn nàynóhợp nhấtổn định trong nhiễm sắc thể của tế bào vật chủE. coli .Các gen
đòihỏi cho chức năng sinh tan được tập hợp lại trong đoạn stuffer,và đượcloạibỏkhi xây dựngcác vectortạodòngcónguồn gốcλ để cóthểnhậncác đoạn DNA có kích thước lênđến 20 kb.Các vector
λ tái tổhợp bao gồmnhánhtrái,nhánhphảivà đoạn DNAngoại lai được gắnvào giữa hainhánh. Kết
quả các thể tái tổhợp sau đó được đónggói trongvỏprotein bằngcáchdùng hệthống đónggói in vitro
chophép xâm nhiễmvào tế bào vậtchủvới hiệu suất cao.
Đối với genome đặc trưng của động vậtcó vú dài 3 109 bp, xấp xỉ khoảng 7 105 thể tái tổ
hợpλ mang các đoạn chèncó kích thước trungbình khoảng20 kb sẽ đảm bảoxác suất 99% mọi đoạn
DNA cần thiết hiện diện trong thư viện.
Cosmidlà plasmid vector mang đầucos của λ(chương4). Vìthế,các cosmidcóthể được đóng
gói trongcác tiểu thể λvới hiệu suất cao. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào vậtchủ, DNAtái tổhợpmạch thẳngtạovòngở đầucos vàtiếp đó được nhân lên như làmột plasmid lớn. Giống như plasmid, cosmid
tương đối dễ thao tác, nhưng có thể nhận các đoạn chèn genomic DNA có kích thước khoảng 40-45 kb, lớn hơn khả năng của phage λ.
4. Các BAC vector
Các BAC vector hiện nay được xem như công cụ hữu hiệu nhất trong việc xây dựng các thư viện genome, do chúng có các ưu điểm sau:
- Có khả năng gắn các đại phân tử DNA 100-300 kb. - Ít hình thành thể khảm (chimera).
- Có hiệu quả cao trong tạo dòng và thu hồi DNA.
- Duy trì sự ổn định của các DNA được gắn vào vector.
Nhờ những ưu điểm trên nên hệ thống BAC thường được dùng để xây dựng bản đồ vật lý. DNA
có thể dễ dàng được phân lập trong các dòng BAC, các dòng phân lập được từ lai khuẩn lạc sẽ được
kiểm tra bằng kỹ thuật DNA fingerprinting thông qua phản ứng cắt của enzyme hạn chế HindIII. Kỹ
thuật fingerprinting cung cấp cho chúng ta thông tin về những phần trùng lặp (overlapping) và không trùng lặp của BAC. Nhờ vậy, có thể hoàn thiện bản đồ vật lý có chất lượng cao, phục vụ cho việc phân
tích genome và chuyển nạp gen sau này.
5. Các YAC vector
Các YAC là các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và cũng là các vector tạo dòng được sử
dụng trong phân tích genome. Chúng mang các đoạn telomere (phần cuối) và centromere (phần tâm)
của một nhiễm sắc thể trong nấm men. Cả hai nhân tố này cần thiết cho sự tái bản của nhiễm sắc thể
trong các tế bào nấm men: nếu không có telomere, thì sauđó các đầu của nhiễm sắc thể có khả năng bị
rời ra hoặc gắn vào các nhiễm sắc thể khác. Nếu không có centromere, thì sauđó các nhiễm sắc thể
mới được tạo thành sẽ không được đẩy vào trong các tế bào mới của quá trình phân chia tế bào. Ngoài ra, còn phải có một gốc tái bản để sao chép DNA.
Các nhân tố này được đặt trong một đoạn DNA đơn, được dùng như một vector để tạo dòng DNA ngoại lai ở trong nấm men. Ưu điểm của YAC là có thể nhận các đoạn DNA có kích thước lớn. Như vậy, trong khi tạo dòng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống bằng cách dùng bacteriophage hoặc các plasmid thường bị giới hạn bởi kích thước của các đoạn DNA được tạo dòng (chỉ vài chục
kilobase), thì các YAC có thể tạo dòng cácđoạn DNA dài hàng ngàn kilobase. Điều này giúp cho việc
lập bản đồ genome hoàn chỉnh dễ dàng hơn nhiều.
Nhược điểm của các YAC đó là kỹ thuật thao tác còn nhiều khó khăn, và một vấn đề chung là DNA từ hai vùng khác nhau của genome gốc có thể kết thúc trong một YAC, dẫn đến xuất hiện sự liên kết sai mà kết quả là tạo ra một dòng khảm.