nitrocellulose sau khi thực hiện diện di SDS-PAGE (xem chương 2).
- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện. Như
vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện của gen thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.
1. Western blot
ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein. Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa
kháng nguyên vào thỏ và được tinh sạch từ máu thỏ sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng
cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năngnhận biết một số kháng nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương tác với một kháng nguyên nhất định.
Hình 7.9. Sơ đồ kỹ thuật Western blot
Kháng thể được đánh dấu bằng bằng enzyme (hoặc bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS-PAGE, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9). Cơ chế của phản ứng
liên kết kháng nguyên-kháng thể được trình bày ở hình 7.10. Sau khi protein trên màng lai gắn với
kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự
hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ)
Hình 7.10. Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong Western blot
Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật
lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot. Ngoài ra, kháng thể được sử
dụng để tinh sạch protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hoặc sắc ký ái lực (affinity
chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét
nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA.
2. ELISA
ELISA là một kỹ thuật hóa sinh, cũng dựa trên phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể, được
dùng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu. Tương tự kỹ thuật Western blot, trong ELISA người thường dùng hai loại kháng thể. Một kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất). Một kháng thể khác, phản ứng với các phức
hợp kháng thể-kháng nguyên, được kết hợp với enzyme (kháng thể thứ hai). Kháng thể thứ hai nhờ có
liên kết với enzyme (như tên của kỹ thuật xét nghiệm) nên có thể bắt màu với cơ chất để tạo ra tín hiệu
Hình 7.11. Sơ đồ kỹ thuật ELISA
Do ELISA có thể thực hiện để đánh giá sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu bằng phương pháp quang phổ (đo độ hấp thụ quang), cho nên nó là công cụ hữu ích để xác định nồng độ (định lượng) kháng nguyên và kháng thể.