Mục đích của bước này là sản xuất các đoạn DNA có độ phóng xạ và hoạt tính đặc hiệu cao để
làm mẫu dò dùng trong các thí nghiệm lai phân tử. Trong trường hợp này dấu phóng xạ thường được
sử dụng là 32P phát xạ b năng lượng cao. Dưới đây là một số phương pháp đánh dấu phổ biến được
trong kỹthuật gen.
1. Đánh dấu ở đuôi
Enzyme polynucleotide kinase xúc tác để chuyển nhóm phosphate nằm cuối ATP sang gốc 5’- OH của các phân tử nucleic acid đã được dephosphoryl hóa. Nếu như ATP được đánh dấu phóng xạ,
thì nó sẽ tạo ra nucleic acid được đánh dấuphóng xạ. Tuy nhiên, hoạt tính đặc hiệu của chúng tương đối thấp, do chỉ có phần đuôi của mỗi phân tử DNA được đánh dấu (Hình 5.9).
Hình 5.9. Đánh dấu ở đuôi của đoạn DNA nhờ enzyme polynucleotide kinase (PNK). (a)
DNA được dephosphoryl hóa bằng enzyme phosphatase để tạo ra các nhóm 5’-OH. (b) Tiếp đó, đuôi
phosphate của [ g-32P]ATP (vòng trònđậm trên hình)được chuyển sang gốc 5’-OH nhờ PNK. Đây là phản ứng trao đổi các nhóm 5’-PO4.
2. Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt
Phương pháp này dựa vào enzyme DNA polymerase I củaE. coli có khả năng dịch chuyển điểm
đứtcủa DNA (xem chương 1). Các điểm đứt có thể xuất hiện tự nhiên và cũng có thể do tác dụng của
enzyme DNase I2ở nồng độ thấp trong hỗn hợp phản ứng. Enzyme DNA polymerase I xúc tác phản ứng thay thế sợi bằng cách xen các dNTP mới vào chuỗi DNA. Nếu một trong các dNTP đãđánh dấu
phóng xạ (ví dụ: [ a-32P]dCTP) , thì kết quả là phân tử DNA sẽ được đánh dấu với hoạt tính đặc hiệu
cao (Hình 5.10).
3. Đánh dấu bằng kéo dài đoạn mồi
Đoạn DNA cần đánh dấu được biến tính bằng nhiệt, sau đó các đoạn mồi oligonucleotide (thường là các phân tử hexadeoxyribonucleotide) được gắn vào các DNA sợi đơn. Sử dụng enzyme
DNA polymerase I có thể tổng hợp nên bản sao mới của sợi khuôn mẫu. Nếu như một dNTP đãđánh
dấu phóng xạ (ví dụ: [ a -32P]dCTP) được gắn vào, thì bản sao DNA mang hoạt họat tính đặc hiệu rất
cao sẽ được tạo ra (Hình 5.11). Cũng có thể dùng kỹ thuật PCR để đánh dấu phóng xạ đoạn DNA trong trường hợp muốn tạo ra một số lượng lớn mẫu dò. Lúc này, enzyme DNA polymerase I sẽ được
Hình 5.10.Đánh dấu DNA bằng dịch chuyển điểm đứt.(a) Dùng DNase I tạo ra một điểm đứt
trên sợi đơn của chuỗi DNA sợi đôi. (b) Tiếp đó enzyme DNA polymerase I tổng hợp một bản sao mới
của sợi khuôn mẫu khi phân hủy sợi có điểm đứt nhờ hoạt tính exonuclease 5’ - 3’ của nó. Nếu [ a-
32
P]dCTP được cung cấp thì nó sẽ gắn vào bản sao mới (các hình tròn bôiđen).
Trong phản ứng đánh dấu phóng xạ, thông thường cần tách DNA đã được đánh dấu khỏi các
nucleotide không được đánh dấu còn thừa trong hỗn hợp phản ứng. Hoạt tính phóng xạ của mẫu dò cần được đánh giá bằng phương pháp đếm nhấp nháy lỏng (liquid scintillation). Các số liệu sau đó được dùng để tính toán lượng mẫu dò cần thiết cho các phản ứng lai phân tử (ví dụ: Southern blot, Northern blot, screening…).
Hình 5.11.Đánh dấu DNA bằng cách kéo dài đoạn mồi.(a) DNA được biến tính để tạo ra các
phân tử sợi đơn. (b) Một đoạn mồi oligonucleotide được bổ sung để gắn với sợi DNA khuôn mẫu. (c)
Enzyme DNA polymerase I xúc tác tổng hợp một bản sao mới của sợi khuôn mẫu bằng cách kéo dài
đoạn mồi, trong quá trìnhđó các [ a-32P]dCTP (các vòng bôiđen) sẽ được đính vào bản sao ở các vị
trí có G.