Các bacteriophage  vector dùng trong tạo dòng cDNA

1. Các bacteriophage vector được dùng phổ biến

Hai loại vector biểu hiện của bacteriophage thường dùng để xây dựng thư viện cDNA là

gt10 vàgt11. Vectorgt10 dùng để xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng các mẫu dò nucleic acid, trong khi vectorgt11 dùng để xây dựng các thư viện được sàng lọc bằng các mẫu dò miễn dịch để phân lập các chuỗi DNA mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu.

1.1. Vectorgt10

gt10 là vector được thiết kế để nhận các đoạn DNA ngoại lai trong vùng mã hóa của gen ức chế cI2. Các vector này mang gen cI, giống như bacteriophage , nó tạo thành các vết tan mờ đục trên hầu hết các chủngE. coli. DNA củagt10 mang vị trí nhận biết đơnEcoRI nằm trong vùng mã

hóa của gencI là nơi mà các đoạn DNA có thể gắn vào. Kết quả chèn đoạn DNA sẽ làm bất hoạt gen cI, sản sinh ra các bacteriophagecI tái tổ hợp và tạo thành các plaque màu sáng, dễ dàng phân biệt

DNA củagt10 bố mẹ xấp xỉ 43 kb và như vậy có thể nhận các đoạn DNA ngoại lai dài tới 7,6 kb. Các thư viện cDNA được xây dựng tronggt10 luôn chứa hỗn hợp các bacteriophage tái tổ hợp và không tái tổ hợp. Hai loại bacteriophage này có thể phân biệt kiểu hình nhờ vào khả năng tạo thành các plaque của chúng.

1.2. Vectorgt11

gt11 là vector biểu hiện mang bản sao của genlacZ củaE. coli, có vị trí nhận biết đơnEcoRI

nằm ở vùng ngược hướng 53 bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ. DNA ngoại lai có kích

thước xấp xỉ 7,2 kb có thể được gắn ở vị trí này. Các chuỗi mã hóa gắn trong khung đọc theo hướng chính xác sẽ được biểu hiện để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) có đầu tận cùng amino chứa các chuỗi -galactosidase và đầu tận cùng carboxyl chứa mạch polypeptide ngoại lai. Một số protein dung hợp này sẽ thể hiện các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitopes) được phát hiện bởi khả năng phản ứng với các kháng thể của chúng.

Các protein dung hợp mang các yếu tố quyết định kháng nguyên ngoại lai có thể được phát hiện bằng cách sàng lọc các plaque với mẫu dò miễn dịch. Bacteriophage được dàn trải ở 42oC trên

E. coli. Sau khoảng 4 giờ, các đĩa petri được chuyển đến nhiệt độ 37oC và được phủ màng lọc vô trùng nitrocellulose có thấm isopropylthio--D-galactoside (IPTG), chất làm bất hoạt gen ức chế lac

và cảm ứng biểu hiện protein ngoại lai. Sau một vài giờ nuôi ở 37oC, các màng lọc được ủ với kháng thể để liên kết với kháng nguyên quan tâm. Các kháng thể này sau đó được phát hiện bằng các xét nghiệm hóa học phóng xạ (radiochemistry) hoặc hóa học mô (histochemistry).

2. Một số bacteriophage vector khác

2.1. Vectorgt18 vàgt19

Hai loại vectorgt18 vàgt19 có nguồn gốc từ vectorgt11 được cải tiến mang vùng tạo dòng (polycloning sites) ở vị tríEcoRI đơn củagt11. Có thể sử dụng hai loại vector này để tạo dòng định hướng và không định hướng cDNA. Hơn nữa, ít nhất một trong các vị trí của vùng tạo dòng (SalI) ít khi xuất hiện trong DNA động vật có vú (trung bình 1 vị trí/đoạn 100 kb), và vì thế ít có khả năng các dòng cDNA có chứa vị tríSalI. Như vậy, các cDNA sợi đôi có đầu bằng mang các linker SalI không

cần phải được bảo vệ bằng cách methyl hóa (methylation) trước khi được thủy phân bằng RE. Khi các đoạn linker được loại bỏ, sẽ dẫn đến kết quả quần thể các phân tử cDNA có thể được gắn trực tiếp với các nhánh củagt18 hoặcgt19.

2.2. Vectorgt20 vàgt21

Các vector gt20 và gt21 có nguồn gốc tương ứng từ gt18 và gt19, và như vậy có nhiều tính chất giống như đã mô tả ởgt18 vàgt19. Những thay đổi đặc biệt so vớigt18 vàgt19 như sau:

- Vị trí tổng hợpchi được đưa vào vector cho phép loại bỏ sự chọn lọc đoạn chèn cDNA chứa

các vị tríchi.

- Các vị tríSacI vàXbaI được loại bỏ khỏi các nhánh của vector sao cho vị tríXbaI ở trong vùng

tạo dòng là duy nhất, các thao tác này làm khuyết một đoạn khoảng 500 bp trong DNA của bacteriophage ở phía bên phải genlac5. Đặc điểm này cho phép nhận các đoạn chèn DNA lớn hơn

(tới 8,2 kb) so với các vectorgt18 vàgt19.

2.3. Vectorgt22 vàgt23

Các vector này cũng bắt nguồn từgt18 vàgt19, mang trình tự tổng hợpchi và các vị trí tạo

dòng trong một khung khác gần đầu 3’ của vùng mã hóa genlacZ. Các vectorgt22 vàgt23 giống hệt nhau ngoại trừ hướng của các vị trí tạo dòng. Các vị tríXbaI vàSacI ở các nhánh củagt18 và

gt19 bị loại bỏ, như vậy các vector này chỉ mang năm vị trí cắt hạn chế duy nhất để tạo dòng là:

NotI,XbaI,SacI,SalI vàEcoRI. Các đoạn cDNA gắn vào một trong năm vị trí có thể được biểu hiện

như là một protein dung hợp LacZ. Các vector gt22 và gt23 được thiết kế để cho phép tạo dòng định hướng cDNA vào trong các vị tríSalI vàNotI. Tổng hợp sợi thứ nhất và thứ hai của cDNA bằng

phương pháp primer-linker cho phép cDNA sợi đôi được cắt bằngSalI vàNotI và gắn trực tiếp trong

các nhánh của vector theo hướng liên quan với promoterlacZ. Một trong ba thể tái tổ hợp sẽ mang

phân tử cDNA trong khung đọc chính xác để sản xuất protein dung hợp.

2.4. VectorZAP

VectorZAP mang vùng tạo dòng cùng hướng với promoterlacZ của E. coli. Đoạn cDNA dài

10 kb có thể được gắn vào trong các vị trí này và biểu hiện hoặc trong vi khuẩn được xâm nhiễm hoặc trong các thể tiềm tan được cảm ứng, như mô tả ởgt11. Hơn nữa, các protein dung hợpZAP có thể được biểu hiện từ các plasmid có số lượng bản sao lớn. VectorZAP có một số đặc điểm như sau:

- Có sáu vị trí RE trong vùng tạo dòng được sử dụng để tạo dòng định hướng các phân tử cDNA, trong đó có một vị trí cắtEcoRI tương tự nhưgt11.

- Có các promoter của bacteriophage T3 và T7 nằm bên cạnh vùng tạo dòng.

- Có các trình tự có nguồn gốc từ bacteriophage f1 để chuyển đổi in vivo đoạn chèn DNA từ

bacteriophage vector tới Bluescript plasmid, các trình tự của nó được chứa trongZAP. Quá trình cắt bỏ được thực hiện dễ dàng nhờ sự bố trí các trình tự của bacteriophage f1 (khởi đầu tổng hợp DNA sợi đơn) về một phía của Bluescript plasmid DNA mang vùng tạo dòng và sự bố trí các trình tự bacteriophage f1 (kết thúc tổng hợp DNA sợi đơn) về một phía khác của plasmid DNA.

VectorZAP là dạng đầu tiên của vector thế hệ mới được thiết kế nhằm cung cấp một trình tự các vị trí tiềm năng để tạo dòng và biểu hiện cDNA, một phương pháp tiện lợi và đơn giản để thu hồi và thực hiện các thao tác tiếp theo của cDNA. Do tính linh hoạt của chúng, các vector này thay thế chogt10 vàgt11 và được xem là vector thích hợp để xây dựng các thư viện cDNA. VectorZAPII cũng tương đồng vớiZAP.