huyền phù tiểu thể trong Tris.HCl có bổ sung urea. Ly tâm và tái huyền phù tiểu thể bằng nước. Trộn dung dịch với đệm 2 SDS gel-loading dye và phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định điều kiện rửa thích hợp cho protein.
1.2.3. Hòa tan các thể vùi
Treo các tiểu thể được rửa trong đệm dung ly chứa PMSF và urea, để 1 giờ ở RT. Bổ sung dung dịch có KH2PO4, EDTA và NaCl để 30 phút ở RT, duy trì pH 10,7 bằng KOH. Điều chỉnh pH tới 8,0 bằng HCl để 30 min ở RT. Ly tâm thu tiểu thể và tái huyền phù bằng đệm 1 SDS gel-loading dye. Phân tích điện di để xác định mức độ hòa tan.
2. Các đuôi ái lực
Khái niệm đuôi ái lực xuất hiện khi thiết kế di truyền với mục đích giúp cho sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn. Gen của protein quan tâm được dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid sẽ đơn giản hóa quá trình tinh sạch protein, bằng cách biến đổi các tính chất của nó trong một kiểu có thể dự đoán. Một trong các trường hợp đầu tiên là dung hợp di truyền của một số gốc arginine với C-terminus của urogastrone. Gen này sẽ sản xuất một protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation. Đuôi polyarginine sau đó được loại bỏ bằng cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A.
Hình 7.12. Tinh sạch protein đích bằng sắc ký ái lực. Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các protein mang một đuôi ái lực (ví dụ: His, Histidine hoặc GST, glutathione-S-transferase). Các chất bẩn sẽ được rửa trôi khỏi cột, và các protein được liên kết trên cột sau đó sẽ được rửa giải ở dạng tinh sạch. Đuôi ái lực có nhiều ưu điểm trong tinh sạch protein. Trong IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), His sẽ liên kết chọn lọc cao với Ni2+ hoặc các kim loại chuyển tiếp khác được bất động trên phối tử, protein có gắn đuôi ái lực có thể được rửa giải chọn lọc bằng imidazole. Protein được gắn đuôi GST liên kết với glutathione như một phối tử, và được rửa giải với các dung dịch glutathione. Các protein có đuôi dung hợp GST mang hoạt tính enzyme chỉ có thể được tinh sạch dưới các điều kiện tự nhiên. Ngược lại, các protein gắn đuôi His có thể được tinh sạch dưới các điều kiện tự nhiên hoặc biến tính.
tinh sạch bằng sắc ký ái lực.1: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. 2: Protein hòa tan tổng số. 3: Protein dung hợp (protein đích và GST) được rửa giải khỏi cột glutathione sepharose. 4: Protein dung hợp được cắt bằng PresCission Protease cho ra 2 băng là GST và protein đích. 5: Protein đích đã được tinh sạch sau khi cho đi qua IMAC.
Khó khăn chủ yếu ở các dung hợp ái lực để tinh sạch protein là phải loại bỏ thành công đuôi ái lực và các tác nhân được sử dụng. Vấn đề này có thể được giải quyết từng phần bằng sự biến nạp di truyền các điểm đặc hiệu cao cho protease hoặc cho sự cắt bỏ các liên kết acid không bền ở chỗ nối của protein tái tổ hợp và đuôi ái lực. Nhiều phương pháp phân cắt đã được gợi ý. Sử dụng các protease đặc hiệu là thích hợp hơn cả, bởi vì có thể ứng dụng trong các điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu là thrombin, enterokinase và Factor Xa. Tất cả những protein này hoạt động ở 37oC và có thể phân cắt ở các vị trí bên trong protein quan tâm, hoặc do mất tính đặc hiệu hoặc từ sự nhiễm bẩn các protease. Cuối cùng, các bước sắc ký tiếp theo sẽ được yêu cầu để loại bỏ đuôi ái lực được phân cắt và protease.
Trong sự phát triển gần đây của lĩnh vực này, người ta đã sử dụng dạng tái tổ hợp của protease 3C từ rhinovirus của người. Protease này có kích thước nhỏ (20 kDa) và có một tính đặc hiệu rất hạn chế. Nó được biểu hiện như là một protein tái tổ hợp được dung hợp với glutathione-S- transferase. Điều này có một vài ưu điểm, bản thân protease có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên glutathione-Sepharose. Nếu protein đích được biểu hiện như là một sự dung hợp với glutathione-S-transferase thì nó có thể được tinh sạch trên cột glutathione-Sepharose. Sau khi xử lý với protease, protein đích có thể được phân tách khỏi đuôi glutathione-S-transferase và protease bằng cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai.
Một cách khác, phản ứng phân cắt có thể được đặt trên cột glutathione-Sepharose thứ nhất bằng cách bổ sung protease vào đệm của cột, vì thế tránh được sự cần thiết cho một cột thứ hai. Protease này có sẵn ở dạng thương mại dưới tên PreCission Protease do Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Hình 7.12 và 7.13).
Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K.
2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed.John Wiley & Sons, Inc. USA.
2. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual.
Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.
3. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,
USA.
4. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.
Blackwell Science, Oxford, UK.
5. Rapley R and Walker JM.1998. Molecular Biomethods Handbook.Humana Press Inc. New
Jersey, USA.
6. Rosenberg IM. 1996. Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques. Birkhäuser,
Boston, USA.
7. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,
8. Walker JM.2002. The Protein Protocols Handbook. 2nd ed.Humana Press Inc. Totowa, New