Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli bằng cách sử dụng promoter điều
hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả. Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ. Trong khi đó, để biểu hiện một gen eukaryote (hoặc một gen prokaryote với một trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp cả promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4). Các mức độ biểu hiện có thể khác nhau từ dưới 1% cho tới hơn 30% protein hòa tan tổng số (total soluble protein) của tế bào.
Hình 7.4. Protein nguyên thể.Gen tạo dòng (gen A) được đặt sau promoter và trình tự SD của vi khuẩn. mRNA chỉ mã hóa các amino acid đặc hiệu của đoạn chèn để tạo ra loại protein nguyên thể.
Biểu hiện của các gen ở prokaryote: Promoter
Bước đầu tiên khi biểu hiện các protein của eukaryote trong vi khuẩn là chọn một vector biểu hiện mang promoter mạnh (strong promoter) của prokaryote. Promoter là trình tự DNA hướng dẫn RNA polymerase liên kết với DNA và khởi đầu sự tổng hợp RNA. Các promoter khác nhau có hiệu suất khác nhau, nói chung, promoter mạnh giúp các mRNA được khởi đầu ở tần số cao. Các promoter khác nhau đều mang hai đoạn bảo toàn cao, một được xác định khoảng 10 bp và một khoảng 35 bp nằm ở vùng ngược hướng (upstream) với điểm khởi đầu của sự phiên mã (còn gọi là vùng 5’ không dịch mã-5’ untranslation region). Hai đoạn này được đánh giá rất quan trọng trong việc xác định cường độ của promoter.
Các promoter thích hợp nhất cho biểu hiện của gen ngoại lai ởE. coli là những promoter mà cả
hai cường độ và khả năng điều hòa thể hiện mạnh. Nếu sản phẩm của gen được tạo dòng là độc (toxin) đối với các tế bàoE. coli thì sau đó sự nhân đôi gen sẽ làm cho cường độ promoter yếu và
DNA của plasmid và dẫn đến tính không ổn định của plasmid.
Phần này giới thiệu các vector biểu hiện mang promoter PL của bacteriophage, promoter (lai)
trp-lac và promoter bacteriophage T7.
1. Promoter PL của bacteriophage
Promoter PL của phage (Hình 7.5) là một promoter mạnh, có khả năng điều hòa tốt và được dùng trong một số vector biểu hiện. Ở nhiệt độ thấp (31oC), promoter PL được duy trì ở trạng thái bị ức chế bởi sản phẩm của gencI. Sau khi hoạt tính của gen ức chế bị phá hủy bằng cách tăng nhiệt
độ nuôi cấy thì promoter PL sẽ xúc tiến phiên mã phần lớn mRNA. Một vài vector sử dụng promoter PLcủa như: pPLa 2311, pPLa 8 và pKC30.
Hình 7.5. Vector pKC30. pKC30 là plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mang promoter PL của bacteriophage và vị trí nhận biếtHpaI nằm ở vùng cùng hướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi
đầu phiên mã của PL. Plasmid này là dạng phân chia của vector pBR322 và chứa đoạn HindIII- BamHI có nguồn gốc từ bacteriophage được chèn vào giữa các vị trí HindIII và BamHI của
vector. Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (PL), một vị trí được nhận biết bởi sản phẩm của genN (nutL), bản thân genN, và tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộcrho (tL). Vị trí nhận biếtHpaI
nằm với vùng mã hóa của gen N. Các trình tự DNA được chèn vào trong vị trí HpaI có thể được
điều chỉnh bằng cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan của bacteriophage mẫn cảm với nhiệt độ (cIts857). Các tế bào được sinh trưởng đến giữa pha log ở 30oC và sau đó thay đổi tới 40oC để bất hoạt sản phẩm của gen cI và mở promoter PL. Vector này được dùng để biểu hiện proteincII của bacteriophage với một mức độ khoảng 4% protein hòa tan tổng số của tế bào.
2. Promotertrp-lac
Sự biểu hiện của các gen được tạo dòng trong vi khuẩn E. colicòn được điều hòa bằng các promoter khác. Chẳng hạn promotertac (một dạng promoter lai giữa promotertrpvà promoterlac) đã
được sử dụng thành công để sản xuất một lượng lớn protein trongE. coli (Hình 7.6).
- Promotertrp được điều hòa bởi gen ức chếtrpvà có thể được cảm ứng bởi sự bổ sung 3-IAA (3-indolylacetic acid) vào môi trường, hoặc bằng cách thiếu tryptophan.
- Promoter lac được điều hòa bởi gen ức chế lac và vì thế có thể được cảm ứng bởi sự bổ
sung nhân tố cảm ứng IPTG cho nuôi cấy vi khuẩn.
- Cuối cùng promoter lai trp-lac chứa đoạn trp-35 gắn với đoạn lac-10 và operator lac được
Boer và cs thiết kế năm 1982, promoter laitrp-lac được điều hòa bởi gen ức chếlac(lac repressor).
Hình 7.6. Vector pKK177-3.pKK177-3 là mộttacvector chứa các vị trí tạo dòng gen ngoại lai cùng hướng với promotertac. Cùng hướng với các vị trí tạo dòng là rrnB mang gen 5S củaE. colivà hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 và T2.
3. Promoter bacteriophage T7
Một hệ thống biểu hiện khác đã được phát triển bởi Tabor và Richardson (1985), Studier và Moffatt (1986) đó là hệ thống bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter (Hình 7.7). Hệ thống này được thiết kế cho các biểu hiện có chọn lọc của gen được tạo dòng. Chúng cho phép mức độ biểu hiện cao của một vài gen không được biểu hiện hiệu quả trong các hệ thống khác.
Hình 7.7. Vector pET-3 mang promoter (PФ10) của bacteriophage T7 Ф10 và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ). Yếu tố kết thúc phiên mã có thể tạo ra các thể phiên mã có sức đề kháng mạnh
hơn đối với hoạt tính exonuclease. Vector pET-3a là dạng phân chia của vector pET-3 trong đó vùng khởi đầu dịch mã (S10) của bacteriophage T7 Ф10 (protein chính của vỏ bacteriophage T7) có mang vị tríBamHI ở codon 11 được đã chèn vào. Vị tríNdeI (CATATG) được đặt ở vùng khởi đầu dịch mã
và có thể được sử dụng để xây dựng plasmid biểu hiện các protein nguyên thể.
bacteriohage và vị trí cắt hạn chế duy nhất BamHI định vị ở codon khởi đầu ATG của gen cII
của bacteriophage. Plasmid này có nguồn gốc từ pKC30, trong đó gen cII của bacteriophage
được chèn vào ở vị tríHpaI. Gen cII sau đó được cắt bỏ bởi enzyme exonuclease cho tới khi chỉ
còn lại codon khởi đầu ATG (G của ATG là nucleotide đầu tiên của vị trí BamHI). Để biểu hiện
gen bị mất codon khởi đầu, pAS1 được cắt bằng BamHI và sau đó xử lý với enzyme mung-bean
nuclease hoặc nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi (đầu tận cùng sợi đơn). Gắn DNA đầu bằng này với đoạn DNA đầu bằng bắt đầu với codon thứ hai của gen được biểu hiện đặt gen đó trong khung với ATG. Các gen được chèn vào theo kiểu này được điều hòa bằng cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào trong thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ của bacteriophage (cIts857). Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn ở 30oC và sau đó nâng lên 40oC để bất hoạt gen ức chế (repressor) và mở promoter PL. Gen được chèn vào cũng có thể được điều hòa bằng hoạt động của protein N ở
nutL vànutR để ngăn cản kết thúc ởtR.
Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của một vài yếu tố: - Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA.
- Khoảng cách giữa chuỗi SD và codon AUG để chuỗi DNA của eukaryote định vị. - Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome.
Đưa codon ATG vào trong gen được tạo dòng và duy trì vị trí liên kết ribosome (RBS) của vi khuẩn bằng cách dùng vector pAS1 (Hình 7.8). Vector pAS1 mang promoter PL và RBS của gencII
của bacteriophage, codon khởi đầu ATG được dung hợp trực tiếp với phần mã hóa đầu tận cùng amino của gen eukaryote muốn biểu hiện. Cách làm này có thể hạn chế việc tối ưu khoảng cách giữa chuỗi SD của vi khuẩn và codon khởi đầu ATG của gen eukaryote để có được sự biểu hiện hiệu quả của gen. Đoạn DNA có gắn promoter và chuỗi SD sau đó được biến nạp vào các chủngE. coli thích
hợp. Sàng lọc thể biến nạp để thu các khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao.