Việcchọn lựa một primer có một ý nghĩa quan trọng khi muốnứngdụng PCRcóhiệuquả và độ chínhxác cao.Vìthế, chúng taphảicómột thiết kế chínhxác về oligonucleotide primer.Trình tự của
primer được chọn xác định kích thước và vị trí của sản phẩm PCR, cũng như Tm của vùng được khuếch đại.Primer được thiết kế đúngcóthể giúp chúng ta tránhtạo ra nhữngsản phẩm PCR không
đặc hiệu (non-specific).
Mục đích của việc thiết kế primerlà có được một sự cân bằng giữa hai kếtquả: sự đặc hiệu và
hiệu suất khuếch đại. Sự đặc hiệu được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng gắn primer nhầm (mis-priming) trên tổng số lần gắn primer (priming) tức là sự lai giữa primer vàkhuôn mẫutạivị trí đíchcủanó. Hiệu suấtlàsự tiếp cận vớilýthuyết vềkếtquả sản phẩm, trong mỗi chukỳ
PCR, một cặp primer cóthể khuếch đại ra mộtsản phẩm. Với mộttrình tự DNA đã được cung cấp người tacóthểphân tích primer trên computerđể cómột kếtquảcân bằng giữa haimục tiêunói trên.
1. Chiềudài primer
Tính đặc hiệu củasản phẩm PCR thườngphụthuộc vào chiềudàicủa primervànhiệt độ ủ.Các oligonucleotide có kích thước khoảng 18-24 base có xu hướng trở thành những trình tự rất đặc hiệu
nếu nhiệt độ ủ của PCR được thiết kế saikhác chỉ vài độso với Tm của primer (nhiệt độ lýthuyết). Primer có chiều dài càng lớn thìkhả năng gắn của primer càng nhỏ. Trong khi khuếch đại, một sự cố nào đó của quá trìnhủ cũng sẽ làm giảm kết quả PCR. Để tối ưu hóa PCR, người ta sử dụng primer có
chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo Tmkhoảng 54oC hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ
hội tốt nhất để duy trì tính đặc trưng của sản phẩm PCR và hiệu suất phản ứng cao. Những
oligonucleotide ngắn(15 base hoặc ngắn hơn)được sử dụng hạn chế trong nhiều quy trình PCR. Chiều
dài primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR làkhoảng 18 nucleotidevàngười ta thường thiết kế các primer có độ dài 18-24 mer. Primer càng ngắn thì quá trình gắn giữa primer và khuôn mẫu DNA càng nhanh, tạo thành sợi đôi ổn định trong tổng hợp DNA. Thông thường, các primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các trình tựcó mức độ dị hợp cao.
Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, có thể sử dụng công thức tínhTm liên hệ với các base:
2. Nucleotide cuốicùngcủa primer
Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sự thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trong codon của nó hoặc ba base trong trường hợp nó được mã hóa bằng codon đơn (methionin vàtryptophan) thì hai hoặc ba base đầu tiên này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và khuôn mẫu cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn, và giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai
(mismatch) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu3’ của primer. Thông thường, việc thêm vào một trình tự không liên quan tại đầu 5’ của primer vẫn không làm thay đổi quá trình gắn mồi.
Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng gắn primer nhầm và ngăn cản hiện tượng tương đồng trong cùng một cặp primer. Nếu không thận trọng trong việc xác định đầu 3’ thì
hiện tượng primer-dimers sẽ xảy ra,vàvới tính chất bổ sung cho nhau sản phẩm PCR lúc bấy giờ sẽlà một sự khuếch đại của chính primer chứkhông phải của DNA khuôn mẫu mà ta mong muốn. Trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplex PCR), chúng ta cần phải
kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer.
3.Hàm lượng GCvànhiệt độ nóngchảy Tm
Primer của PCR phải duy trìđược hàm lượng GC đến mức có thể được. Những oligonucleotide
có 20 base với 50% GC thường có giá trịTm trong khoảng 56-62oCsẽtạo điều kiện để quá trìnhủ đạt
kết quả tốt. Hàm lượng GC và Tm phải khớp với một cặp primer được thiết kế. Nếu giá trịTm càng lớn thì cơ hội cho hiện tượng gắn primer nhầm càng cao.Do đó, khi thiết kế primer cần phải lưu ý đặc biệt
đến hàm lượng GC.