Sử dụng thư viện cDNA có hai ưu điểm sau:
- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen. Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều đoạn intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các đoạn intron đã bị loại và mRNA hoàn thiện (mature mRNA) có trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA hoàn thiện nên các dòng cDNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong muốn.
- Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA của một vài loại mRNA nào đó làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.
Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Các bước chính của quá trình xây dựng thư viện cDNA như sau:
1. Chọn lọc kích thước của cDNA
thừa và các phân tử cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có kích thước 270,3 cm thích hợp cho việc phân đoạn các cDNA.
2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage
Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophageđược gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5 106 bacteriophage tái tổ hợp.
Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage không tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.
Việc sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa hoặc các nhánh có đầu tận cùng không tương thích, tạo ra bằng cách lấp đầy từng phần, được khuyến cáo sử dụng khi xây dựng thư viện cDNA trong các bacteriophage nhưgt11, gt18-23 vàZAP, là những vector không có hệ thống cho phép chọn lọc dựa theo các bacteriophage bố mẹ. Số lượng các thể không tái tổ hợp có thể được giảm xuống khoảng 100 lần bằng cách dùng các nhánh dephosphoryl hóa. Trong hệ thống này, các bacteriophage không tái tổ hợp tạo thành các plaque màu xanh trên các chủngE. coli thích hợp khi
có mặt của IPTG và X-gal, trong khi đó các plaque tái tổ hợp là không màu.
3. Phân tích các đoạn chèn cDNA
Thu thậpkhoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổhợpvàchuẩnbịDNAđểcắt bằng RE
thích hợp. Phântíchkích thướccủacác đoạn chèn cDNA bằng điện di trên agarose gel 1%,dùng DNA markercó các đoạn từ500 bp tới5 kb. Nếu các bacteriophage tái tổhợp chứacác đoạn chèncó kích thướckhác nhauvànếukích thước trungbìnhcủa chúng xấp xỉ1 kb hoặc lớn hơn,thì cóthểtiếnhành
các bước tiếp theo (ví dụ:tạo ra thư viện cDNA hoànchỉnh). Nếu kích thước trungbìnhcủacác đoạn chènnhỏ hơn1 kb mộtcáchrõrệt,thìchất lượngcủa thư việnlàkhông cao. Trong trường hợpnày cần quaylại phântích chất lượngcủa mRNA khởi đầuvà cácphảnứng tổng hợp cDNA.
4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh
Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các plaque không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl hóa, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các thể tái tổ hợp. Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành phần ở một tỷ lệ thích hợp. Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của bacteriophage mà không chứa cDNA. Đóng gói tất cả các hỗn hợp gắn bằng cách thiết kế một chuỗi các phản ứng gắn, mỗi phản ứng chứa 0,5 g các nhánh của bacteriophage . Gộp các tiểu thể đóng gói và xác định độ chuẩn của bacteriophage gốc trên các chủng vi khuẩn thích hợp.
5. Khuếch đại thư viện cDNA
-Vectorgt10. Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì nó cần phải được khuếch
đại bằng sự sinh trưởng trên chủngE. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) trên đĩa agar. Nếu
thư viện chỉ được sàng lọc một lần, bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các bacteriophage có thể được dàn mỏng trực tiếp trên chủng BNN102 ở một mật độ tối ưu để tiến hành sàng lọc.
-Vectorgt11 và các dẫn xuất của nó vàZAP,ZAPII. Các thư viện cDNA được xây dựng
trong các vector biểu hiện gt11, gt18, gt20 và gt22 phải được khuếch đại trên chủng E. coli
Y1090hsdR (hoặc nếu là vector ZAP thì trên chủng BB4, vector ZAPII thì trên chủng XL1-Blue). Các chủng này là không hoàn hảo cho sự cắt hạn chế kiểm soát vật chủ nhưng lại mang một hệ thống methyl hóa hoạt động. Các vị trí tiềm tàng cho phản ứng cắt hạn chế bằng hệ thốngEcoK sẽ
được methyl hóa trong suốt quá trình khuếch đại sao cho, nếu cần thiết, các thể tái tổ hợp có thể được dùng để gây nhiễm chủng E. colikhả biến-cắt hạn chế. Trong suốt quá trình khuếch đại, điều quan trọng là ức chế sản xuất các protein độc tố tiềm tàng bới các bacteriophage tái tổ hợp.
Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K.
2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed.John Wiley & Sons, Inc. USA.
2. Brown TA.2001. Gene Cloning-An Introduction. 4thed.Blackwell Science, Oxford, UK.
3. Calladine CR and Drew HR. 1997. Understanding DNA: The Molecule and How It Works.2nd ed.Academic Press, London, UK. 2nd ed.Academic Press, London, UK.
4. Glick BR and Pasternak JJ.2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications ofRecombinant DNA. 3rd ed.ASM Press, USA. Recombinant DNA. 3rd ed.ASM Press, USA.
5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold
Spring Habor Laboratory Press, USA.
6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,
USA.
7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.
Blackwell Science, Oxford, UK.
8. Rapley R and Walker JM.1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New
Jersey, USA.
9. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,
Heidelberg, Germany.
1
Vòng cặp tóc: hình dạng của phân tử DNA hoặc RNA được dùng làm mồi cho quá trình tổng hợp sợi thứ hai.
2
Chương 7
Biểu hiện gen tái tổ hợp trong
Escherichia coli
Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trongEscherichia coli.
Những vector như thế được dùng để biểu hiện các gen của eukaryote trong E. coli hoặc tăng hiệu
suất các sản phẩm của gen ở prokaryote. Mặc dùE. coli không phải là một vật chủ lý tưởng để biểu
hiện các gen của eukaryote do chúng không có khả năng sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho các chuỗi polypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, trong một số trường hợp người ta vẫn có thể sử dụng vi khuẩnE. coli cho những protein có cấu trúc đơn giản hơn.
Đối với những protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường được sử dụng là các cơ thể eukaryote (ví dụ: nấm menSaccharomyces cerevisiae,nấm mốcAspergillus niger…) do chúng có thể hậu dịch mã
được.
Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trongE. coli phải bắt đầu bằng việc gắn đoạn gen ngoại lai
vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid). Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau: - Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào.
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ:lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn
mRNA từ các gen được tạo dòng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG.
- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter.
Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang gen ngoại lai mới được biến nạp vào chủngE. coli thích hợp.
Chương này mô tả các phương pháp và các plasmid vector được sử dụng để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) và các protein nguyên thể (native protein) trong vi khuẩn. Các protein dung hợp có thể được sản xuất với một lượng lớn, dễ dàng tinh sạch và có thể được dùng để gây ra một đáp ứng miễn dịch. Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong vi khuẩn bằng cách gắn một promoter mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả ngược hướng với gen được tạo dòng (vùng 5’ không dịch mã). Thông thường, các protein được biểu hiện ở mức độ cao trong các thể vùi không hòa tan.