+ Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. + Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. + Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide. 1.2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I củaE. coli
Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA sợi đôi. Do DNA polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt tính exonuclease 5’3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì vậy, khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn lớn của DNA polymerase I).
- Ứng dụng chính
+ Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng [ a -32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’.
+ Tổng hợp sợi thứ hai của cDNA trong tạo dòng cDNA.
+ Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biếnin vitro.
1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infectedE. coli)
Enzyme này giống đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli . DNA polymerase của
phage T4 (M = 114.000 Da) có hoạt tính polymerase 5’3’ và exonuclease 3’5’ . Tuy nhiên, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I đến 200 lần. Đoạn Klenow phải cần có đoạn mồi (primer) mới tổng hợp DNA được, còn DNA polymerase phage T4 thì không cần mồi cũng tổng hợp được DNA.
- Ứng dụng chính
+ Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
+ Đánh dấu đầu tận cùng của các phân tử DNA mang đầu lồi 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow.
+ Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò.
+ Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase
(Thermus aquaticus)
Taq DNA polymerase (Taq pol) là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (M = 65.000 Da) của vi khuẩn Thermus aquaticus. Enzyme này được dùng để kiểm tra sự có mặt hoặc không của một gen
bằng cách xúc tác cho sự tổng hợp gen đó ở điều kiện in vitro nhờ phản ứng chuỗi polymerase
(PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I củaE. coli do có khả năng chịu nhiệt
cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72oC.
- Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing.
- Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn.
Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ
Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt
hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từThermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi
có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase)
(Bacteriophage SP6-infectedSalmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected
E. coli)
Các bacteriophage SP6, T7 và T3 sản xuất enzyme RNA polymerase để khởi đầu tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng bacteriophage. Quá trình tổng hợp này không cần mồi.
- Ứng dụng chính
+ Sản xuất RNA để làm mẫu dò.
+ Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3.
+ Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA.
3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase)
Đây là enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA. Enzyme này có ở trong các virus: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuộc nhóm virus ngược (retrovirus: virus mang RNA) và có các hoạt tính sau:
DNA (sợi đơn hoặc sợi đôi):
- Hoạt tính RNase H. Bao gồm hai hoạt tính exoribonuclease 5’3’ và 3’5’ phân hủy cácDNA hoặc RNA trong tổ hợp lai. DNA hoặc RNA trong tổ hợp lai.
Enzyme này được dùng trong kỹ thuật di truyền là nhờ vào khả năng tổng hợp được cDNA của chúng (xem chương 6).
Người ta có thể tách chiết mRNA ở những tế bào tổng hợp protein mạnh, sau đó dùng enzyme reverse transcriptase để tổng hợp cDNA. Có thể tổng hợp nên oligonucleotide rồi dùng nó để xác
định trình tự của DNA.
4. Terminal transferase
(Tuyến ức của bê)
Hoạt tính của enzyme này là xúc tác gắn các nucleotide vào đầu 3’-OH tự do của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối sợi DNA. Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng.
- Ứng dụng chính
+ Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo dòng (xem chương 6).
+ Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert.