Quy trình PCR

- Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer (F và R) - Taq pol - 4 loại dNTP - Đệm và các muối khoáng Hình 3.5. Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo 2. Thực hiện phản ứng

Dưới đây là ví dụminh họa cho mộtphảnứng khuếch đại:

2.1. Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các

thành phần sau: Đệm 10× PCR 4,5L Hỗn hợp4 dNTP (2,5 mM mỗiloại) 4L Primer-F (10 pmol/L) 2,5L Primer-R (10 pmol/L) 2,5L Thêm H2O tới 40L

2.2. Chuẩn bị dung dịch phaloãngcủa Taq pol:

Đệm ×10 2L

Thêm H2O tới 20L

Hình 3.6.Sơ đồ kỹthuật PCR đảo ngược

2.3. Bổ sung 5L DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40L dung dịch của master mix tube.

2.4. Bổsung 2L/1 tube dungdịch phaloãngcủa Taq pol.

2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chế độ nhiệt

theo chu kỳ như sau:

- Start program - 95oC/5 phút

- Thực hiện 30 chukỳ: 95oC/30 giây, 50oC/30 giâyvà72oC/1 phút - 72oC/10 phút

- Giữ sản phẩm PCR ở 4oC

- Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR(Hình 3.7)

- Nếu chưa chạy điện dithì bảoquảnsản phẩm PCR ở-20oC

Chúý

- Các thành phần và điều kiện của phảnứng như:Độdài của primer, chế độnhiệt trong một chukỳ, số chukỳ đối với mỗi đối tượng có thể thay đổi ít nhiều bằng thực nghiệm. Các thông sốtrênchỉcóý nghĩa tham khảo.

- Nếu làm nhiều mẫu, có thể trộn chung các thành phần khác trừ DNA và Taq pol, sau đó chia ra từng tube rồi cho DNA và Taq polvào sau cùng.

Hình 3.7.Điện di các sản phẩm PCR. SM: Chuẩn kích thước DNA. Các đường số1, 2, 3, 4và 5: Cácsản phẩm PCR khác nhau.