Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR,
bao gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất. Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNA thứ nhất, sau đó dùng sợi
này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai (tương tự như giai đoạn thứ nhất và thứ hai của quá
trình tổng hợp cDNA-xem chương 6).
Giai đoạn thứhai. Dùng DNA sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR như đã trình bàyở trên.
RNA được cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil) liên kết với
nhau tạo thành một chuỗi đơn. Khi chuỗi nucleotide này được biến đổi thành DNA thì uracil (U)được
thay thế bằng thymine (T). Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ nhất phải nhờ đến một
enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT), sau đó quá trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là DNA polymerase I
(thường dùng đoạn Klenow). Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ
phản ứng khuếch đại một đoạn DNA từ khuôn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói trên được gọi là RT-PCR.
Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là RNA (retrovirus) nên muốn khuếch đại một đoạn
gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RT-PCR. Một số nghiên cứu khác về mRNA cũng cần đến
sequencing) hay tái tổ hợp (recombination) trong nghiên cứu biểu hiện gen.