CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.4. Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế tự đông tụ của vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng tự đông tụ (không dùng dung môi p-xylen) cho hiệu suất cao (>50%), xác định được thời gian phù hợp để vi khuẩn tạo sự tựđông tụ cho hiệu suất cao nhất. Từ đó làm cơ sở xác định cơ chế tự động của vi khuẩn.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn có hiệu suất cao với dung môi
p-xylen được tuyển chọn (32 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 32 x 3 = 96.
c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). Mỗi chủng
dung tích 250 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Tại các thời điểm
24, 36, 48, 60, 72 giờ; lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn đo quang phổ (OD660); lấy 2,0 ml dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi khuẩn ở phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo
OD660. Hiệu suất tự đông tụ của mỗi chủng vi khuẩn được tính bằng công thức:
HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf không ly tâm - ODs: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf sau ly tâm
3.4.5 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế đông tụ của từng cặp vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được ít nhất 04 cặp chủng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ
cao (>70%) và xác định được thời gian phù hợp để cặp chủng vi khuẩn hoạt động
cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: chọn 08 chủng vi khuẩn có hiệu suất tự đông tụ cao được bố trí theo cặp đối đầu xoay vòng. Số cặp chủng vi khuẩn được bố trí thí
nghiệm theo công thức:
2
1 n
n
N c (n là số chủng vi khuẩn có hiệu suất tự
đông tụ được chọn; N(c) là tổng số cặp chủng vi khuẩn được thực hiện thí nghiệm).
Tổng số 28 cặp vi khuẩn được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần
lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 28 x 3 = 84.
c. Thực hiện:theo phương pháp (Kimchhayarasy et al., 2009)
(i) Chuẩn bị dịch vi khuẩn: mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường
polypepton lỏng với thể tích bằng [(n-1) x 50 ml x 3 lần] = (A ml) trong bình tam giác có dung tích phù hợp, đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC,
nuôi đến thời điểm vi khuẩn đạt mật độ > 109 CFU/ml đã được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982). [n là số chủng vi
khuẩn]. Lấy A ml dịch vi khuẩn cho vào ống, ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl +
0,5 mM CaCl2) đã chuẩn bị trước; sinh khối được hòa tan và chứa trong A ml dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở bình tam giác có dung tích phù hợp. Dịch vi khuẩn được chuyển vào ống, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, chuyển 50% dịch vi khuẩn ở phía trên ống ly tâm qua bình tam giác có dung tích phù hợp (loại bỏ các tế bào tự đông tụ ở đáy ống ly tâm), điều chỉnh dịch vi khuẩn
về mức OD660 = 0,3, pH = 7.
(ii) Xác định hiệu suất đông tụ ở từng cặp chủng vi khuẩn (28 cặp): mỗi
chủng lấy 20 ml dịch vi khuẩn phối hợp theo từng cặp (tỉ lệ 1:1), cho vào bình tam giác có dung tích 150 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Tại các
thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi
khuẩn của mỗi cặp chủng vi khuẩn để đo OD660 (OD0), phần còn lại để yên 10 phút
sau đó hút 2,0 ml dịch vi khuẩn ở phía trên cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo OD660 (ODs). Hiệu suất đông tụ của cặp chủng vi khuẩn được tính bằng công
thức: HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, trước ly tâm nhẹ - ODs: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, sau ly tâm nhẹ
3.4.6 Khảo sát các yếu tố trong môi trường (pH, cation Ca2+, Mg2+, Na+, K+) ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn
3.4.6.1 Xác định yếu tố pH môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định giá trị pH trong môi trường thích hợpđể vi khuẩn đông
tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên. Thí nghiệm trên 01 nhân tố pH (ở các mức 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0), 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị
thí nghiệm: 4 x 7 x 3 = 84
c. Thực hiện: mỗi chủng vi khuẩn được chuẩn bị giống như ở thí nghiệm 3.4.5.
Tuy nhiên giai đoạn điều chỉnh dịch vi khuẩn về mức OD660 = 0,3 và pH được điều
chỉnh lần lượt ở các giá trị là 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho mỗi lần thực hiện thí
nghiệm. Xác định hiệu suất đông tụ của từng cặp chủng vi khuẩn: Mỗi chủng vi
khuẩn lấy 20 ml dịch huyền phù đã chuẩn bị ở trên (tỷ lệ 1:1) cho vào bình tam
giác có dung tích 150 ml, đặt trên máy lắc có tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ
30oC, lắc liên tục trong thời gian xác định ở thí nghiệm 3.4.5, tiến hành đo OD và
tính hiệu suất đông tụtheo phương pháp (Kimchhayarasy et al. 2009) giống như thí
nghiệm 3.4.5 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.2 Xác định yếu tố cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ trong môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định được nồng độ và loại cation thích hợp trong môi trường để vi khuẩn đông tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt trên từng nhân tố cation [4 loại cation là Ca2+, Mg2+, K+, Na+ (với các mức nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM)], 3 lần
c. Thực hiện: chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan lần lượt trong các dung dịch muối CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl ở lần lượt các nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM cho mỗi
lần thực hiện thí nghiệm. pH được điều chỉnh giá trị phù hợp nhất được ghi nhận ở
thí nghiệm 3.4.6.1, các bước tiếp theo tiến hành giống như thí nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.3 Phối hợp cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp có trong môi trường để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất
a. Mục đích: chọn được cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp nhất để vi
khuẩn đông tụ hoạt động với hiệu suất cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 04 cặp cation (hóa trị
1 và hóa trị 2 mức nồng độ phù hợp nhất ở thí nghiệm 3.4.6.2, 3 lần lặp lại.
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 4 x 3 = 48
c. Thực hiện: Chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan lần lượt trong từng cặp dung dịch muối
cation hóa trị 1 và hóa trị 2 [CaCl2 + NaCl; CaCl2 + KCl; MgCl2 + NaCl; MgCl2 + KCl (tỷ lệ 1:1)]. Nồng độ cation của mỗi loại muối được chọn ở thí nghiệm
3.4.6.2. Phối hợp từng cặp chủng vi khuẩn và tính hiệu suất đông tụ giống như thí
nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.4 Xác định yếu tố phối hợp pH và cặp cation trong môi trường có giá trị phù hợp để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ tốt nhất
a. Mục đích:Xác định tính tương quan giá trị pH và nồng độ cation hóa trị 1
và hóa trị 2 trong môi trường phù hợp nhất để vi khuẩn động tụ hoạt động cho hiệu
suất cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 2 nhân tố [pH, cặp
cation (Mg2++K+)], với 3 lần lặp lại.
+ Nhân tố thứ nhất: pH môi trường thực hiện ở các giá trị 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0
+ Nhân tố thứ hai: Cặp cation được chọn ở thí nghiệm 3.4.6.3 (A1+A2) với
các mức nồng độ của từng loại cation hóa trị 2 là:10 mM, 20 mM, 30 mM; cation hóa trị 1 là: 20 mM, 30 mM, 40 mM được xác định ở thí nghiệm 3.4.6.2
Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 4 x 9 x 5 x 3 = 540
c. Thực hiện: Chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan trong dung dịch muối của cặp cation (A1+ A2) (tỷ lệ 1:1) với các nồng độ được phối hợp ngẫu nhiên của hai loại muối lần
lượt ở các nồng độ (A2.10 + A1.20; A2.10 + A1.30; A2.10 + A1.40; A2.20 + A1.20; A2.20 + A1.30; A2.20 + A1.40; A2.30 + A1.10; A2.20 + A1.20; A2.30 + A1.30 mM).
pH được điều chỉnh lần lượt ở các mức 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 cho mỗi lần thực hiện
thí nghiệm ở mỗi cặp cation. Phối hợp từng cặp chủng vi khuẩn và tính hiệu suất đông tụ giống như thí nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.7 Xác định tỷ lệ giống vi khuẩn đông tụ ứng dụng xử lý nước thải
a. Mục đích: nhằm xác định liều lượng giống vi khuẩn đông tụ được bổ
sung phù hợp nhất để xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas cho hiệu suất đông
tụ cao nhất
c. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 1 nhân tố (liều lượng
giống vi khuẩn ở các tỷ lệ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1%), 01 nghiệm thức đối chứng dương (bổ sung 0,05% PAC, không bổ sung vi
khuẩn); 01 nghiệm thức đối chứng âm (không bổ sung PAC và vi khuẩn), với 3 lần
lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm : 12 x 4 x 3 = 144
c. Thực hiện: 04 cặp chủng vi khuẩn đông tụ được chọn ở thí nghiệm 3.4.5,
tiến hành kiểm tra hiệu suất đông tụ của mỗi cặp chủng vi khuẩn khi bổ sung lượng vi khuẩn lần lượt với các tỷ lệ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1% cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm. Quy trình kiểm tra hiệu suất đông tụ ở mỗi cặp chủng vi khuẩn đông tụ như sau:
- Lấy 36 bình tam giác loại 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 100 ml nước
thải chăn nuôi heo sau biogas.
- Chỉ số pH và muối kim loại được chọn ở mức tối ưu theo kết quả các thí nghiệm tương ứng ở trên.
- Bổ sung 0,05% PAC và dung dịch cặp chủng vi khuẩn (tỷ lệ 1:1) vào mỗi
bình lần lượt với các liều lượng 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1 % (mật độ vi khuẩn lớn hơn hoặc bằng 109 CFU/ml). Mẫu đối chứng dương
không bổ sung vi khuẩn, mẫu đối chứng âm không bổ sung vi khuẩn và PAC (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2010; trích từ Gong et al., 2008).
- Đặt trên máy lắc 120 vòng/phút trong 6 giờ; để yên 18 giờ; lấy phần trong
cách mặt nước 2 - 3 cm của mỗi bình đem đo OD660nm; tính hiệu suất đông tụ theo
công thức ở thí nghiệm 3.4.5
3.4.8 Ứng dụng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô phòng thí nghiệm và trại chăn nuôi heo
a. Mục đích: nhằm xác địnhđược hiệu suất đông tụ của vi khuẩn trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas, xác định chất lượng nước sau quá trình xử lý so
b. Bố trí thí nghiệm quy mô 08 lít tại phòng thí nghiệm:được bố trí theo thể
thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức (Bảng 3.2), lặp lại 3 lần, tổng số 18
đơn vị thí nghiệm, mỗi đơn vị thí nghiệm 08 lít, thực hiện trong bình nhựa 10 lít,
để bảo đảm cho nước không bị tràng ra ngoài khi sục khí (Hình 3.2)
c. Thực hiện: thí nghiệm được tiến hành trong 3 chu kỳ.
- Chu kỳ 1: các nghiệm thức được bổ sung vi khuẩn và PAC (Bảng 3.2), sục khí liên tục 6 giờ (công suất 0,05 m3/phút), sau đó để yên, tại thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 giờ, tiến hành lấy mẫu phân tích và tính hiệu suất đông tụ. Cuối chu kỳ
1 tổng thời gian vận hành là 24 giờ, tiến hành lấy 50% nước trong ở phần trên bình
ra (4 lít), thêm lượng nước thải mới vào đầy bình (bằng với lượng nước lấy ra). - Chu kỳ 2: các nghiệm thức sục khí liên tục 1 giờ, để yên 6 giờ (tại thời