L ời cam đoan
3.4.1. Phân lập, khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa và định lượng vi khuẩn
nước thải chăn nuôi heo sau biogas
3.4.1.1 Phân lập, quan sát hình thái và sinh hóa
Môi trường Polypepton phân lập vi khuẩn đông tụ(Kimchhayarasy et al., 2009) Polypepton: 10 g; (NH4)2SO4: 1 g; NaNO3: 0,5 g; NaCl: 0,1 g; MgSO4·7H2O: 0,2 g; CaCl2·2H2O: 0,05 g; FeCl3·6H2O: 0,01 g ; K2HPO4: 1 g; nước: 1 lít; pH: 7.
Quy trình phân lập, quan sát hình thái, đo kích thước vi khuẩn, quan sát
khuẩn lạc, nhuộm Gram vi khuẩn và trữ mẫu thuần, thực hiện theo quy trình của; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, (2000); Nguyễn Đức Lượng và ctv., (2006); Trần Linh Thước, (2007).
Một ml mẫu nước thải được pha loãng với 99 ml nước cất đã khử trùng, cho vào bình tam giác 250 ml → pha loãng 102; 1 ml độ pha loảng 102 + 9 ml nước cất
cho vào ống nghiệm 20 ml → pha loãng 103; 1 ml độ pha loảng 103 + 9 ml nước
cất cho vào ống nghiệm 20 ml → pha loãng 104. Mỗi độ pha loãng lấy 20 µl trãi
đều trên môi trường thạch polypepton , ủ trong 24 – 48 giờở 30oC.
Tách thuần từng khuẩn lạc bằng cách cấy chuyển tiếp sang môi trường thạch
vài lần quan sát thấy khuẩn lạc rời đều, chọn khuẩn lạc tách rời trên đường cấy, khuẩn lạc có bề mặt trơn, nhầy và ướt được tách chuyển ra ống trữ nghiêng. Kết
hợp kiểm tra thuần trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần, quan sát sự tương đồng hình dạng của vi khuẩn, để chọn một chủng riêng biệt. Mỗi chủng được quan sát đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào, khả năng chuyển động và nhuộm Gram vi khuẩn.
Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc: cấy chuyền vi khuẩn trên môi
trường thạch, sau 24, 36, 48 giờ nuôi, đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet
và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường.
Quan sát hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn: sau khi phân lập
và tách thuần vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi
khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở thị kính 10x, vật
kính 40x. Nhỏ 20 μl nước cất vô trùng lên lam kính; khử trùng kim cấy trên ngọn
lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lam kính; đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn. Tiến hành quan sát mẫu, ghi nhận hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần. Quan sát hình thái, kích thước vi khuẩn bằng kỹ thuật chụp
hình dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm kép của Schaefea và Fulton theo quy trình nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus cereus (Nguyễn Đức Lượng
và ctv., 2006).
Nhuộm Gram vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram của Christian Gram
theo quy trình nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus cereus (Trần Linh Thước, 2007).
Phép thử khả năng sản sinh ra catalase theo quy trình của Andretta et al.
(2004): nhỏ giọt H2O2 3% lên đĩa khuẩn lạc. Sau 1 – 2 giây quan sát, nếu có bọt
3.4.1.2 Bảo quản, cấy chuyền và nhân giống
- Bảo quản mẫu thuần: các chủng vi khuẩn đã thuần đem cấy trữ mẫu trong
ống chứa môi trường phân lập vi khuẩn (trữ 3 ống), bảo quản trong tủ lạnhở nhiệt độ từ 7 - 8oC (có thể trữ được 3 tháng, sau đó tiếp tục cấy chuyền). Các chủng vi
khuẩn đã phân lập ròng được cất trữ trong glycerol 20%, ở nhiệt độ từ -20oC đến - 70oC có thể trữ được trong thời gian 2 đến 3 năm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu
Hiệp, 2002), (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2006).
- Cấy chuyền nhân giống: dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm thuần từống nghiệm thạch nghiêng đang lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới (môi
trường phân lập). Đểống nghiệm trong tủấm, nuôi ủở 30oC trong 24 giờ.
+ Nhân giống cấp 1: hút 1 ml nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn, lắc đều. Hút 100 l dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
+ Nhân giống cấp 2: xác định mật độ trong giống cấp 1 theo thời gian. Khi mật độ vi khuẩn trong giống cấp 1 đến giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyền tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy ủ lắc, vận tốc 120 vòng/phút, ở
nhiệt độ 30oC. Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn được vệ
sinh sạch và dùng máy sục khí với tốc độ phù hợp để thay cho máy lắc. Kiểm tra mật độ vi khuẩn đạt >109 CFU/ml thì sử dụng được (Trần Linh Thước, 2007).
3.4.1.3 Định lượng vi khuẩn
Xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt của Hoben
và Somasegaran, (1982) thực hiện theo quy trình (Hình 3.1)
Công thức tính mật độ vi khuẩn: Số khuẩn lạc/ml = A × 100 × B A: là số khuẩn lạc đếm được trung bình của 5 giọt (số khuẩn lạc /10 µl)
B: Mức độ pha loãng
100: Hệ số chuyển từ 10 µl đến ml
3.4.2 Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh hóa
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao
thông qua hiệu suất hấp thụ của p-xylen với vi khuẩn (chọn chủng vi khuẩn có hiệu
suất >50%) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập thuần ở thí nghiệm trước
(124 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng
số đơn vị thí nghiệm 124 x 3 = 372.
c. Thực hiện: kiểm tra sinh hóa 124 chủng vi khuẩn đông tụ với dung môip-
xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ được xác định dựa trên hiệu suất hấp thụ của p-xylen với tế bào vi khuẩn theo phương pháp của Rosenberg
et al., (1980). Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong 20 ml môi trường polypepton
lỏng (môi trường phân lập) trong ống falcon, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ, lấy 10 ml dịch vi khuẩn ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2), sinh khối được hòa tan, chứa trong 10 ml dung
dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở ống nghiệm thứ nhất. Lấy 5 ml dịch
huyền phù từ ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai cùng với 5 ml
p-xylen, trộn đều dịch huyền phù với p-xylen bằng máy vortex trong 1 phút, để
yên 5 phút. Đo quang phổ ở bước sóng 660 nm (OD660) dịch huyền phù trong ống
nghiệm có thêm p-xylen và dịch huyền phù trong ống nghiệm không thêm p-xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn được tính thông qua chỉ số OD660 bằng
công thức tính hiệu suất đông tụ:
HS (%) = 100 0 0 OD OD OD m (Kimchhayarasy et al., 2009) (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù vi khuẩn không có p-xylen
- ODm: OD dịch huyền phù vi khuẩn có thêm p-xylen (dùng micropipette hút
phần dung dịchở phía đáy ống nghiệm)
3.4.3 Nhận diện, định danh vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh học phân tử
a. Mục tiêu: xây dựng được mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh được ít nhất 13 chủng vi
khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL bằng phương
pháp sinh học phân tử.
b. Thực hiện: (i) Mỗi chủng vi khuẩn được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường Luria Bertani (LB) để thu sinh khối. DNA vi khuẩn được tách chiết theo
quy trình (Neumann et al.,1992), phản ứng PCR với cặp mồi (Zhao et al., 2010) có trình tự sau: 8F: 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’; 1492R: 5’ - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với
nồng độ 25 µl: H2O: 12,25 µl; Buffer + (NH4)2SO4:2 µl; MgCl2: 2 µl; dNTPs: 4 µl: 8F: 1 µl; 1492R: 1 µl: DMSO:0,5 µl: Taq-polymerase: 0,25 µl: DNA: 2 µl. Phản ứng PCR: 95oC/5’; 35 chu kỳ: (95oC/30”, 53oC/30”, 72oC/1,30”); 72oC/10; 10oC/’.
(ii) Sản phẩm PCR được tiến hành chạy điện di một chiều 90V máy Biorad SGE- 014-02 ( Mỹ) và chụp hình gel-Rad Universal Hood II (Mỹ). Chọn sản phẩm PCR
có band trên phổ điện di tương đồng mức 1.500 bp ở thang chuẩn plus 100. (iii) Sản
phẩm PCR được chọn, tiến hành tinh sạch bằng kit Invitrogen và gửi công ty
MACROGEN (Hàn quốc) giải trình tự DNA. (iv) Sử dụng chương trình BLAST N
để so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn cần so sánh với trình tự đoạn gen 16S rRNA trong cơ sở dữ liệu NCBI. Các trình tự 16S rRNA của vi
khuẩn có tỉ lệ tương đồng cao (98% trở lên), được công bố trong công trình nghiên cứu cùng lĩnh vực xử lý môi trường hoặc lĩnh vực gần và không có các thông số
không an toàn với môi trường, các trình tự này được chọn để so sánh cặp với nhau
(multi-aligned) bằng chương trình CLUSTALW 1.6, xây dựng mối tương quan truyền các chủng vi khuẩn nghiên cứu với các chủng vi khuẩn có tỉ lệ tương đồng
cao từ cơ sở dữ liệu NCBI bằng chương trình MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011), vẽ
cây phát sinh loài dạng Neighbor-joining 1000 lần lặp lại. (v) Định danh vi khuẩn
dựa trên mối tương quan di truyền của các chủng vi khuẩnđược thể hiện ở cây phát
sinh loài. Xác định tính đa dạng trình tự nucleotide của các chủng vi khuẩn đông tụ
bản địa bằng chương trình DNAsp 5.1 và bioEdit (Truong Trong Ngon et al., 2012; trích từ Halushka et al., 1999).
3.4.4 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế tự đông tụ của vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng tự đông tụ (không dùng dung môi p-xylen) cho hiệu suất cao (>50%), xác định được thời gian phù hợp để vi khuẩn tạo sự tựđông tụ cho hiệu suất cao nhất. Từ đó làm cơ sở xác định cơ chế tự động của vi khuẩn.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn có hiệu suất cao với dung môi
p-xylen được tuyển chọn (32 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 32 x 3 = 96.
c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). Mỗi chủng
dung tích 250 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Tại các thời điểm
24, 36, 48, 60, 72 giờ; lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn đo quang phổ (OD660); lấy 2,0 ml dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi khuẩn ở phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo
OD660. Hiệu suất tự đông tụ của mỗi chủng vi khuẩn được tính bằng công thức:
HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf không ly tâm - ODs: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf sau ly tâm
3.4.5 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế đông tụ của từng cặp vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được ít nhất 04 cặp chủng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ
cao (>70%) và xác định được thời gian phù hợp để cặp chủng vi khuẩn hoạt động
cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: chọn 08 chủng vi khuẩn có hiệu suất tự đông tụ cao được bố trí theo cặp đối đầu xoay vòng. Số cặp chủng vi khuẩn được bố trí thí
nghiệm theo công thức:
2
1 n
n
N c (n là số chủng vi khuẩn có hiệu suất tự
đông tụ được chọn; N(c) là tổng số cặp chủng vi khuẩn được thực hiện thí nghiệm).
Tổng số 28 cặp vi khuẩn được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần
lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 28 x 3 = 84.
c. Thực hiện:theo phương pháp (Kimchhayarasy et al., 2009)
(i) Chuẩn bị dịch vi khuẩn: mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường
polypepton lỏng với thể tích bằng [(n-1) x 50 ml x 3 lần] = (A ml) trong bình tam giác có dung tích phù hợp, đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC,
nuôi đến thời điểm vi khuẩn đạt mật độ > 109 CFU/ml đã được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982). [n là số chủng vi
khuẩn]. Lấy A ml dịch vi khuẩn cho vào ống, ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl +
0,5 mM CaCl2) đã chuẩn bị trước; sinh khối được hòa tan và chứa trong A ml dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở bình tam giác có dung tích phù hợp. Dịch vi khuẩn được chuyển vào ống, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, chuyển 50% dịch vi khuẩn ở phía trên ống ly tâm qua bình tam giác có dung tích phù hợp (loại bỏ các tế bào tự đông tụ ở đáy ống ly tâm), điều chỉnh dịch vi khuẩn
về mức OD660 = 0,3, pH = 7.
(ii) Xác định hiệu suất đông tụ ở từng cặp chủng vi khuẩn (28 cặp): mỗi
chủng lấy 20 ml dịch vi khuẩn phối hợp theo từng cặp (tỉ lệ 1:1), cho vào bình tam giác có dung tích 150 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Tại các
thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi
khuẩn của mỗi cặp chủng vi khuẩn để đo OD660 (OD0), phần còn lại để yên 10 phút
sau đó hút 2,0 ml dịch vi khuẩn ở phía trên cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo OD660 (ODs). Hiệu suất đông tụ của cặp chủng vi khuẩn được tính bằng công
thức: HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, trước ly tâm nhẹ - ODs: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, sau ly tâm nhẹ
3.4.6 Khảo sát các yếu tố trong môi trường (pH, cation Ca2+, Mg2+, Na+, K+) ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn
3.4.6.1 Xác định yếu tố pH môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định giá trị pH trong môi trường thích hợpđể vi khuẩn đông
tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên. Thí nghiệm trên 01 nhân tố pH (ở các mức 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0), 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị
thí nghiệm: 4 x 7 x 3 = 84
c. Thực hiện: mỗi chủng vi khuẩn được chuẩn bị giống như ở thí nghiệm 3.4.5.
Tuy nhiên giai đoạn điều chỉnh dịch vi khuẩn về mức OD660 = 0,3 và pH được điều
chỉnh lần lượt ở các giá trị là 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho mỗi lần thực hiện thí
nghiệm. Xác định hiệu suất đông tụ của từng cặp chủng vi khuẩn: Mỗi chủng vi
khuẩn lấy 20 ml dịch huyền phù đã chuẩn bị ở trên (tỷ lệ 1:1) cho vào bình tam
giác có dung tích 150 ml, đặt trên máy lắc có tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ
30oC, lắc liên tục trong thời gian xác định ở thí nghiệm 3.4.5, tiến hành đo OD và
tính hiệu suất đông tụtheo phương pháp (Kimchhayarasy et al. 2009) giống như thí
nghiệm 3.4.5 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.2 Xác định yếu tố cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ trong môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định được nồng độ và loại cation thích hợp trong môi trường để vi khuẩn đông tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt trên từng nhân tố cation [4 loại cation là Ca2+, Mg2+, K+, Na+ (với các mức nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM)], 3 lần
c. Thực hiện: chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan lần lượt trong các dung dịch muối CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl ở lần lượt các nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM cho mỗi