L ời cam đoan
4.2Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas
4.2.1 Khảo sát sự tự đông tụ của mỗi chủng vi khuẩn
Kết quả khảo sát hiệu suất tự đông tụ của các tế bào vi khuẩn có cùng đặc
tính di truyền không dùng dung môi p-xylen cho thấy, trong thời gian 24 giờ nhân
nuôi vi khuẩn và sau 10 phút để yên, các tế bào vi khuẩn tự kết dính với nhau tạo
thành khối lớn dần và lắng xuống đáy cho hiệu suất đông tụ cao nhất từ 51,0 – 87,2%. Sự liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau được thể hiện rõ dưới kính
hiển vi điện tử quét (Hình 4.12). Kết quả cho thấy, tốc độ gom tụ và lắng của
chủng vi khuẩn đông tụ trong dịch huyền phù rất nhanh (Hình 4.12a). Quan sát Hình 4.12b, 4.12c, 4.12d, 4.12e cho thấy, các tế bào vi khuẩn đông tụ có cùng đặc
tính di truyền liên kết lại với nhau bằng cầu nối tế bào với tế bào, thông qua cơ chế
B. megaterium AG07 Bacillus sp. AG08 B. megaterium CT03 Entrerobacter DT07 B. cereus KG05 B. subtilis CM01 B. cereus CM03 B. thuringiensis BL01 B. megaterium HG10 B. aryabhattai ST02 B. megaterium TV06 B. megaterium VL01 Bacillus sp. VL05 B. megaterium BT02 Bacillus sp. BT05 B. aryabhattai TG02 Bacillus sp. TG09 B. megaterium LA04
kết dính các vùng kỵ nước trên bề mặt của từng tế bào vi khuẩn tạo nên sự đông tụ. Kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của Malik et al. (2003), các tế bào có tính kỵ nước cao chúng tự kết dính lại với nhau tạo thành khối rồi tự lắng, quá trình này gọi là sự tự đông tụ. Kết quả phân tích thống kê cho thấy, 32 chủng vi khuẩn có
tính kỵ nước cao được tuyển chọn đều có hiệu suất đông tụ cao nhất ở thời gian
nuôi sinh khối 24 giờ, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% so với các mốc thời
gian nuôi sinh khối 36, 48 và 60 giờ. Qua đó cho thấy hiệu suất tự đông tụ còn phụ
thuộc vào thời gian tăng trưởng của vi khuẩn, sau thời giantăng trưởng cực đại của
vi khuẩn thì hiệu suất đông tụ sẽ giảm dần cho đến cực tiểu.
Hình 4.12: Vi khuẩn tự đông tụ trong môi trường polypepton (24 giờ)
Ghi chú: (a). Dịch vi khuẩn chủng B. cereus KG05 nuôi 24 giờ trong môi trường Polypepton (b). Chủng vi khuẩn B. cereus KG05 chụp ảnh (SEM) độ phóng đại 13.000 lần (c). Chủng vi khuẩn B. aryabhattai ST02 chụp ảnh (SEM) độ phóng đại 4.300 lần (d). Chủng vi khuẩn B. megaterium VL01 chụp ảnh (SEM) độ phóng đại 6.5000 lần (e). Chủng vi khuẩn Bacillus sp.VL05 chụp ảnh (SEM) độ phóng đại 16.000 lần
Ngày chụp hình: 11/04/2013
a b
c d
Tùy vào cấu trúc bề mặt tế bào, vùng kỵ nước trên bề mặt tế bào của từng
chủng khác nhau tác động đến cơ chế kết dính của chúng, từ đó làm cho hiệu suất
tự đông tụ của các chủng vi khuẩn khác nhau. Kết quả nghiên cứu chọn được
16/32 chủng vi khuẩn đông tụ có hiệu suất tự đông tụ từ 51,0 – 87,2%. Hiệu suất
tự đông tụ của các chủng vi khuẩn này giảm dần ở các mốc thời gian nuôi sinh khối sau 24 giờ (Bảng 4.6).
Bảng 4.6: Hiệu suất tự đông tụ 16 chủng vi khuẩn đông tụ được tuyển chọn
Chủng vi khuẩn đông tụ Hiệu suất tự đông tụ (%±SD)
24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Bacillus cereus KG05 87,2a ±6,41 73,0b ±21,5 54,0c ±18,3 44,2d ±23,8 Bacillus megaterium VL01 82,1a ±9,16 63,4b ±19,2 49,3c ±17,1 15,6d ±17,9 Bacillus sp. VL05 58,9a ±6,82 53,5b ±17,3 36,8c ±12,2 28,0d ±15,7 Bacillus megaterium TV06 58,2a ±5,83 46,9b ±5,5 31,9c ±10,3 27,8d ±11,5 Bacillus aryabhattai ST02 56,7a ±7,85 43,3b±18,9 46,4b ±22,7 19,7c ±11,2 Bacillus megaterium CT03 55,8a ±0,61 49,4b ±7,49 27,5c ±7,30 25,1c ±7,29 Bacillus thuringiensis BL01 55,4a ±0,94 43,3b ±6,74 34,5c ±12,1 33,9c ±8,84 Enterobacter DT07 54,5a ±0,92 43,6b ±8,15 30,6c ±5,77 29,0c ±6,92 Bacillus aryabhattai TG02 53,4a±3,55 8,3c ±13,1 18,0b ±13,8 7,9c ±11,8 Bacillus megaterium HG04 53,2a ±4,21 31,7b ±7,38 28,6b,c ±5,32 24,8c ±3,0 Bacillus sp. AG08 53,2a ±1,69 42,7b ±15,8 17,6d ±0,98 33,9c ±39,2 Bacillus sp. TG09 53,2a ±5,0 35,0b ±7,68 20,3c ±7,32 11,9d ±3,13 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bacillus megaterium LA04 52,9a ±1,70 42,6b ±5,49 39,4b ±4,68 17,8c ±7,42
Bacillus megaterium CT02 52,5a ±0,35 18,7b ±21,6 14,6b,c ±14,6 9,0c ±10,8
Bacillus cereus CM03 52,3a ±3,28 25,8b ±12,7 28,2b ±17,6 12,2c ±6,87
Bacillus sp. BT05 51,0a ±1,39 22,2b ±19,7 10,0c ±1,31 7,6c ±6,5
Ghi chú: các giá trị trên cùng một hàng mang ký tự mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê mức 1%
Kết quả đếm mật độ vi khuẩn đông tụ ở thời gian nhân nuôi vi khuẩn 24 đến
30 giờđạt >109 tế bào/ml, tương quan với kết quả Bảng 4.6 cho thấy 24 giờ là thời
gian vi khuẩn tăng sinh khối cực đại và có ảnh hưởng đến hiệu suất tự đông tụ của
vi khuẩn. Bởi vì khi sinh khối phát triển cực đại thì các tế bào vi khuẩn chiếm ưu
thế trong môi trường, từ đó khoảng cách các tế bào càng gần nhau, khi ấy các tế
bào có tính kỵ nước cao càng dễ tiếp xúc và chúng kết dính lại với nhau cùng với
các vật chất lơ lửng trong môi trường, tạo thành khối rồi lắng xuống đáy làm cho phần nước ở trên được giảm bẩn, hiệu suất đông tụ tăng lên. Khi thời gian nuôi
sinh khối tăng lên vượt qua mốc thời gian tối ưu, thì hiệu suất đông tụ ở tất cả các
khuẩn này đạt rất thấp (dưới 15%), thậm chí các chủng vi khuẩn B. megaterium
CT03, Bacillus sp. BT05, B. aryabhattai TG02, hiệu suất đông tụ chỉ còn dưới
10%. Bởi vì, sau thời gian tăng trưởng vi khuẩn chuyển sang giai đoạn già và chết
dần, do đó sự kết dính của nhiều tế bào vi khuẩn dần bị biến mất, các tế bào vi khuẩn hòa cùng môi trường dẫn đến chỉ số quang phổ (OD600) tăng lên. Từ kết quả thu được nhận thấy rằng, hiệu suất tự đông tụ của vi khuẩn phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn. Đối với chủng vi khuẩn B. cereus KG05 có hiệu
suất tự đông tụ cao nhất (87,2%) và kết quả kiểm tra sinh hóa với p-xylen lại có hiệu suất hấp thụ với p-xylen cao nhất, vì tế bào chủngB. cereus KG05 có tính kỵ nước cao nên sức hút của tế bào vi khuẩn với dung môi p-xylen sẽ lớn và nhanh chóng tạo thành khối lắng xuống, cuối cùng chỉ số OD660 thấp nhất và hiệu suất
hấp thụ với p-xylen cao nhất (81,8%), tiếp theo chủng B. cereus KG05 là các chủng vi khuẩn B. megaterium VL01, Bacillus sp. VL05, B. megaterium TV06,
B. aryabhattai ST02 cũng có hiệu suất tự đông tụ khá cao lần lượt là 82,1%, 58,9%, 58,2%, 56,7% và các chủng này cũng có hiệu suất hấp thụ với p-xylen khá tốt (cao hơn 50%).
Như vậy, nhờ tính kỵ nước của tế bào vi khuẩn bước đầu giúp cho vi khuẩn có cùng đặc tính di truyền thực hiện cơ chế tự đông tụ (tự kết dính) trong môi
trường đạt hiệu suất cao. Kết quả này, tương đồng với kết quả của Malik et al.
(2003), sự đông tụ vi sinh vật trong bùn hoạt tính gồm nhiều dạng vi khuẩn khác nhau trong đó có cả vi khuẩn không có khả năng kết tụ, các vi khuẩn này tự kết
dính với nhau nhờ tính kỵ nước của bề mặt tế bào, từ đó các hạt rắn hữu cơ, vô cơ
trong môi trường nước được gom tụ thành các hạtto hơn nhờ quá trình đông tụ của
vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với kết quả của Kimchhayarasy et al.
(2009). Đặc biệt là chủng B. cereus KG05 rất tương đồng với chủng B. cereus
strain S24 được phân lập trong bùn hoạt tính. B. cereus strain S24 tiếp xúc với
dung môi p-xylen cho hiệu suất rất cao và tự đông tụ cao nhất (40%) so với 16 chủng phân lập được trong bùn hoạt tính. Kết quả này cũng cho thấy chủng
B. cereus strain S24 có bề mặt tế bào kỵ nước rất cao và cũng là kết quả của sự tự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kết dính tế bào với nhau rất tốt tạo được sự đông tụ trong môi trường nước cao
nhất. Thời gian tiếp xúc của các tế bào vi khuẩn với nhau có ảnh hưởng đến hiệu
suất đông tụ, cơ chế này phụ thuộc hoàn toàn vào đường sinh trưởng của từng
chủng vi khuẩn qua đó hiệu quả hoạt động của vi khuẩn được phát huy tốt. Theo
Chen, (2007) đã nghiên cứu chủng vi khuẩn D6 đại diện của phylotype H phân lập
từ bùn hoạt tính cho thấy, hiệu quả hoạt động đông tụ tối ưu của chủng vi khuẩn
D6 là từ 26 đến 55 giờ, sau 60 giờ thì chỉ số đông tụ bắt đầu giảm dần cho đến 120
giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian sinh trưởng cực đại của vi khuẩn đông
tụ là 24 giờ, sau thời gian này hiệu suất đông tụ dần cho đến cực tiểu là 36 giờ
có hiệu suất tự đông tụ cao hơn 50%, tiếp tục thực hiện thí nghiệm tiếp theo, để
tìm ra được cặp vi khuẩn đông tụ có bề mặt tế bào kỵ nước cao, đồng thời bề mặt
tế bào vi khuẩn có phải tính phù hợp nhất (vùng kỵ nước lớn) khi tế bào khác đặc
tính di truyền tiếp xúc nhau từ đó cặp chủng vi khuẩn đông tụ này mới phát huy được khả năng tạo sự đông tụ trong xử lý nước thải cho hiệu suất cao nhất.
4.2.2 Khảo sát sự đông tụ của các cặp vi khuẩn đông tụ
Tám trong 16 chủng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao từ 54,4 – 87,2% gồm
chủng B. cereus KG05, B. megaterium VL01, Bacillus sp. VL05, B. aryabhattai
ST02, B. megaterium CT03, B. megaterium TV06, B. thuringiensis BL01,
Enterobacter DT07 được chọn để khảo sát hiệu suất đông tụ của 28 cặp tế bào vi khuẩn khác nhau về đặc tính di truyền, đồng thời xác định thời gian tối ưu khi các
cặp vi khuẩn tiếp xúc với nhau cho hiệu suất đông tụ cao nhất. Kết quả đã chọn được 4 cặp chủng vi khuẩn cho hiệu suấtđông tụ cao đạt 71,2 – 88,1% là B. cereus
KG05 + B. megaterium VL01; B. cereus KG05 + Bacillus sp. VL05; B. cereus
KG05 + B. aryabhattai ST02; B. megaterium VL01 + Bacillus sp. VL05, thuộc 3 tỉnh Kiên Giang, Vĩnh Long và Sóc Trăng, thời gian các tế bào vi khuẩn tiếp xúc
kết dính nhau cho hiệu suất cao nhất là 6 giờ, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức
1% so với các mốc thời gian còn lại và khác biệt có ý nghĩa so với 24 cặp chủng vi
khuẩn còn lại khi thực hiện thí nghiệm. (Hình 4.13).
Hình 4.13: Hiệu suất đông tụ (%) của 4 cặp chủng vi khuẩn đông tụ
Từ kết quả thống kê và Hình 4.13 cho thấy, sự khác biệt của các giá trị hiệu
suất đông tụ được kiểm tra, có thể nhận định thời gian đông tụ và sự tổ hợp các
suất đông tụ đạt được cao nhất khi cặp vi khuẩn tiếp xúc nhau ở thời gian 6 giờ,
với các giá trị hiệu suất đông tụ của 4 cặp chủng vi khuẩn được chọn nằm trong
khoảng từ 71,2 – 88,1% , khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99% so với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn khác tại các mốc thời gian còn lại. Khi cặp
vi khuẩn tiếp xúc nhau 1 giờ, hiệu suất đông tụ của các cặp vi khuẩn đạt rất thấp
(28,3 – 48,8%). Hiệu suất đông tụ được tăng lên ở thời gian 3 giờ đạt từ 52,9 – 65,4%. Tại thời gian tiếp xúc 6 giờ, sự đông tụ của vi khuẩn đạt được tối ưu nhất đạt từ 71,2 – 88,1%. Trong đó, cặp vi khuẩn B. cereus KG05 + B. megaterium
VL01 có hiệu suất đông tụ 88,1%, tiếp theo là cặp B. megaterium VL01 + Bacillus
sp. VL05; B. cereus KG05 + Bacillus sp. VL05 và B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02. Thời gian tiếp xúc của các cặp chủng vi khuẩn sau 6 giờ thì hiệu suất đông tụ của
các cặp vi khuẩn đều giảm và giảm thấp nhất ở mốc thời gian 12 giờ. Nguyên nhân là do giai đoạn đầu khi mới tổ hợp cặp chủng vi khuẩn vào nhau, chúng cần có thời
gian thích nghi với môi trường và nhận biết nhau. Khi mật độ vi khuẩn đạt cực đại
thì sự tương tác các tế bào với nhau diễn ra càng mạnh mẽ, các tế bào có tính kỵ nước cao bao gồm cả tế bào có cùng hoặc khác nhau về đặc tính di truyền sẽ kết
dính với nhau hình thành các liên kết tế bào. Qua đó các vật chất lơ lửng trong môi
trườngđược gom lại tạo thành khối cùng với tế bào vi khuẩn và lắng xuống đáy.
Quá trình tạo sựđông tụ cũng cần thời gian phù hợp nhất định để thực hiện
cho hiệu suất cao, do vậy ở mốc thời gian ban đầu (1 – 3 giờ) hiệu suất đông tụ còn thấp, khi thời gian phối hợp vượt khỏi giai đoạn tối ưu (6 giờ) của quá trình đông
tụ cùng với lúc này tế bào chuyển sang giai đoạn già, khả năng tăng sinh khối
giảm, sự tích tụ các chất độc ngày càng tăng do chính vi khuẩn loại thải vào môi
trường, tất cả các yếu tố này là nguyên nhân làm giảm hiệu suất đông tụ. Trong các
tổ hợp cặp vi khuẩn, cặp vi khuẩn B. cereus KG05 + B. megaterium VL01; B. cereus
KG05 + Bacillus sp. VL05; B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02; B. megaterium
VL01 + Bacillus sp. VL05 có hiệu suất đông tụ cao từ 71,2 – 88,1% so với các cặp
vi khuẩn còn lại, nguyên nhân là do cả bốn chủng B.cereus KG05, B. megaterium
VL01, Bacillus sp. VL05, B. aryabhattai ST02 đều có tính kỵ nước cao (yếu tố
quan trọng trong cơ chế đông tụ) và đạt hiệu suất tự đông tụ cao hơn so với các
chủng còn lại và khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 1% (Bảng 4.6). Đây còn là kết
quả của sự kết đôi phụ thuộc và thời gian thu sinh khối của các chủng vi khuẩn để
tiến hành tổ hợp các chủng vi khuẩn với nhau, sự đông tụ giữa các chủng vi khuẩn có liên quan đến thời gian tương tác của chúng, điều này được Rickard et al.,
(2002) theo dõi sự đông tụ của các cặp vi khuẩn tổ hợp từ các chủng
B. natatoria 2.1; B. natatoria 2.6; B. natatoria 2.3; M. luteus 2.13. Kết quả là thời gian đầu sự đông tụ của các cặp vi khuẩn không đáng kể hoặc không diễn ra, đến
một thời điểm tối ưu thì hiệu suất đông tụ tăng đến một giá trị tối đa, tùy thuộc vào
dính. Sự đông tụ của các cặp vi khuẩn được duy trì cho đến 50 giờ, sau đó các cặp
vi khuẩn tách nhau và phân tán quá trình đông tụ dừng lại. Một trường hợp khác, sự đông tụ của 2 chủng vi khuẩn Propioniferax PG-02 và Commamonas sp. sau khi qua thời gian sự đông tụ có hiệu suất cao nhất, hiện tượng phân tán của các cụm tế bào trong dung dịch được ghi nhận lại, điều này được giải thích là do sự
tích tụ của phenol gây độc cho các chủng vi khuẩn khi thời gian kéo dài, làm suy thoái và chết các tế bào vi khuẩn (Chen, 2007). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu quả hoạt động của vi khuẩn đông tụ rất cao và cho thấy các chủng vi
khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao chúng đều có khả năng tự kết dính cũng như
kết dính tốt với các tế bào khác trong cộng đồng vi khuẩn với nhau, qua đó các hạt lơ lửng trong môi trường sẽ được liên kết lại nhờ sự kết dính của các tế bào vi khuẩn. Như vậy, các tế bào vi khuẩn làm cầu nối cho vật chất vô cơ, hữu cơ lơ
lửng trong nước kết dính lại, các chất hữu cơ lơ lửng trong môi trường nước còn là nguồn cacbon cung cấp cho vi khuẩn tồn tại và tăng sinh khối, cuối cùng khối liên kết vi khuẩn và các vật chất lơ lửng được gom lại, tăng lên thành khối lớn rồi lắng
xuống làm giảm lượng chất ô nhiễm trong môi trường. Sự kết dính của cặp tế bào vi khuẩn đông tụ B. cereus KG05 + B. aryabhattai ST02 được kiểm tra dưới kính
hiển vi điện tử quét (Hình 4.14).
Hình 4.14: Sự kết dính của cặp vi khuẩn đông tụ
Ghi chú: Cặp B. cereus KG05 + B. megaterium ST02chụp dưới Kính hiển vi điện tử quét, độ phóng đại 2.200 lần - Ngày chụp hình: 11/04/2013
Quan sát hình 4.14 và so sánh với (Hình 4.11c, 4.11d) cho thấy giữa tế bào chủng B. cereus KG05 có hình que dài hơn tế bào chủng B. aryabhattai ST02. Kết
quả cho thấy, khi cặp vi khuẩn được bổ sung vào môi trường nhờ tính kỵ nước của
bề mặt tế bào đã tạo sự kết dính các tế bào với nhau làm cầu nối liên kết các vật