L ời cam đoan
3.4.2.Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh hóa
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao
thông qua hiệu suất hấp thụ của p-xylen với vi khuẩn (chọn chủng vi khuẩn có hiệu
suất >50%) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập thuần ở thí nghiệm trước
(124 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng
số đơn vị thí nghiệm 124 x 3 = 372.
c. Thực hiện: kiểm tra sinh hóa 124 chủng vi khuẩn đông tụ với dung môip-
xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ được xác định dựa trên hiệu suất hấp thụ của p-xylen với tế bào vi khuẩn theo phương pháp của Rosenberg
et al., (1980). Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong 20 ml môi trường polypepton
lỏng (môi trường phân lập) trong ống falcon, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ, lấy 10 ml dịch vi khuẩn ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2), sinh khối được hòa tan, chứa trong 10 ml dung
dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở ống nghiệm thứ nhất. Lấy 5 ml dịch
huyền phù từ ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai cùng với 5 ml
p-xylen, trộn đều dịch huyền phù với p-xylen bằng máy vortex trong 1 phút, để
yên 5 phút. Đo quang phổ ở bước sóng 660 nm (OD660) dịch huyền phù trong ống
nghiệm có thêm p-xylen và dịch huyền phù trong ống nghiệm không thêm p-xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn được tính thông qua chỉ số OD660 bằng
công thức tính hiệu suất đông tụ:
HS (%) = 100 0 0 OD OD OD m (Kimchhayarasy et al., 2009) (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù vi khuẩn không có p-xylen
- ODm: OD dịch huyền phù vi khuẩn có thêm p-xylen (dùng micropipette hút
phần dung dịchở phía đáy ống nghiệm)
3.4.3 Nhận diện, định danh vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh học phân tử
a. Mục tiêu: xây dựng được mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh được ít nhất 13 chủng vi
khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL bằng phương
pháp sinh học phân tử.
b. Thực hiện: (i) Mỗi chủng vi khuẩn được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường Luria Bertani (LB) để thu sinh khối. DNA vi khuẩn được tách chiết theo
quy trình (Neumann et al.,1992), phản ứng PCR với cặp mồi (Zhao et al., 2010) có trình tự sau: 8F: 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’; 1492R: 5’ - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với
nồng độ 25 µl: H2O: 12,25 µl; Buffer + (NH4)2SO4:2 µl; MgCl2: 2 µl; dNTPs: 4 µl: 8F: 1 µl; 1492R: 1 µl: DMSO:0,5 µl: Taq-polymerase: 0,25 µl: DNA: 2 µl. Phản ứng PCR: 95oC/5’; 35 chu kỳ: (95oC/30”, 53oC/30”, 72oC/1,30”); 72oC/10; 10oC/’.
(ii) Sản phẩm PCR được tiến hành chạy điện di một chiều 90V máy Biorad SGE- 014-02 ( Mỹ) và chụp hình gel-Rad Universal Hood II (Mỹ). Chọn sản phẩm PCR
có band trên phổ điện di tương đồng mức 1.500 bp ở thang chuẩn plus 100. (iii) Sản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phẩm PCR được chọn, tiến hành tinh sạch bằng kit Invitrogen và gửi công ty
MACROGEN (Hàn quốc) giải trình tự DNA. (iv) Sử dụng chương trình BLAST N
để so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn cần so sánh với trình tự đoạn gen 16S rRNA trong cơ sở dữ liệu NCBI. Các trình tự 16S rRNA của vi
khuẩn có tỉ lệ tương đồng cao (98% trở lên), được công bố trong công trình nghiên cứu cùng lĩnh vực xử lý môi trường hoặc lĩnh vực gần và không có các thông số
không an toàn với môi trường, các trình tự này được chọn để so sánh cặp với nhau
(multi-aligned) bằng chương trình CLUSTALW 1.6, xây dựng mối tương quan truyền các chủng vi khuẩn nghiên cứu với các chủng vi khuẩn có tỉ lệ tương đồng
cao từ cơ sở dữ liệu NCBI bằng chương trình MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011), vẽ
cây phát sinh loài dạng Neighbor-joining 1000 lần lặp lại. (v) Định danh vi khuẩn
dựa trên mối tương quan di truyền của các chủng vi khuẩnđược thể hiện ở cây phát
sinh loài. Xác định tính đa dạng trình tự nucleotide của các chủng vi khuẩn đông tụ
bản địa bằng chương trình DNAsp 5.1 và bioEdit (Truong Trong Ngon et al., 2012; trích từ Halushka et al., 1999).
3.4.4 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế tự đông tụ của vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng tự đông tụ (không dùng dung môi p-xylen) cho hiệu suất cao (>50%), xác định được thời gian phù hợp để vi khuẩn tạo sự tựđông tụ cho hiệu suất cao nhất. Từ đó làm cơ sở xác định cơ chế tự động của vi khuẩn.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn có hiệu suất cao với dung môi
p-xylen được tuyển chọn (32 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 32 x 3 = 96.
c. Thực hiện: theo phương pháp của Kimchhayarasy et al. (2009). Mỗi chủng
dung tích 250 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Tại các thời điểm
24, 36, 48, 60, 72 giờ; lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn đo quang phổ (OD660); lấy 2,0 ml dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi khuẩn ở phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo
OD660. Hiệu suất tự đông tụ của mỗi chủng vi khuẩn được tính bằng công thức:
HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf không ly tâm - ODs: OD dịch huyền phù trong tube eppendorf sau ly tâm
3.4.5 Xác định hiệu suất đông tụ từ cơ chế đông tụ của từng cặp vi khuẩn
a. Mục tiêu: chọn được ít nhất 04 cặp chủng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ
cao (>70%) và xác định được thời gian phù hợp để cặp chủng vi khuẩn hoạt động
cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: chọn 08 chủng vi khuẩn có hiệu suất tự đông tụ cao được bố trí theo cặp đối đầu xoay vòng. Số cặp chủng vi khuẩn được bố trí thí
nghiệm theo công thức:
2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 n
n
N c (n là số chủng vi khuẩn có hiệu suất tự
đông tụ được chọn; N(c) là tổng số cặp chủng vi khuẩn được thực hiện thí nghiệm).
Tổng số 28 cặp vi khuẩn được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần
lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm 28 x 3 = 84.
c. Thực hiện:theo phương pháp (Kimchhayarasy et al., 2009)
(i) Chuẩn bị dịch vi khuẩn: mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường
polypepton lỏng với thể tích bằng [(n-1) x 50 ml x 3 lần] = (A ml) trong bình tam giác có dung tích phù hợp, đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC,
nuôi đến thời điểm vi khuẩn đạt mật độ > 109 CFU/ml đã được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982). [n là số chủng vi
khuẩn]. Lấy A ml dịch vi khuẩn cho vào ống, ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl +
0,5 mM CaCl2) đã chuẩn bị trước; sinh khối được hòa tan và chứa trong A ml dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở bình tam giác có dung tích phù hợp. Dịch vi khuẩn được chuyển vào ống, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, chuyển 50% dịch vi khuẩn ở phía trên ống ly tâm qua bình tam giác có dung tích phù hợp (loại bỏ các tế bào tự đông tụ ở đáy ống ly tâm), điều chỉnh dịch vi khuẩn
về mức OD660 = 0,3, pH = 7.
(ii) Xác định hiệu suất đông tụ ở từng cặp chủng vi khuẩn (28 cặp): mỗi
chủng lấy 20 ml dịch vi khuẩn phối hợp theo từng cặp (tỉ lệ 1:1), cho vào bình tam giác có dung tích 150 ml, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Tại các
thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ, dùng micropipette hút 1,5 ml dịch vi
khuẩn của mỗi cặp chủng vi khuẩn để đo OD660 (OD0), phần còn lại để yên 10 phút
sau đó hút 2,0 ml dịch vi khuẩn ở phía trên cho vào tube eppendorf, ly tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút, lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn phía trên eppendorf vừa ly tâm để đo OD660 (ODs). Hiệu suất đông tụ của cặp chủng vi khuẩn được tính bằng công
thức: HS (%) = 100 0 0 OD ODs OD (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, trước ly tâm nhẹ - ODs: OD dịch huyền phù cặp chủng vi khuẩn, sau ly tâm nhẹ
3.4.6 Khảo sát các yếu tố trong môi trường (pH, cation Ca2+, Mg2+, Na+, K+) ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của vi khuẩn
3.4.6.1 Xác định yếu tố pH môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định giá trị pH trong môi trường thích hợpđể vi khuẩn đông
tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên. Thí nghiệm trên 01 nhân tố pH (ở các mức 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0), 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị
thí nghiệm: 4 x 7 x 3 = 84
c. Thực hiện: mỗi chủng vi khuẩn được chuẩn bị giống như ở thí nghiệm 3.4.5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tuy nhiên giai đoạn điều chỉnh dịch vi khuẩn về mức OD660 = 0,3 và pH được điều
chỉnh lần lượt ở các giá trị là 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho mỗi lần thực hiện thí
nghiệm. Xác định hiệu suất đông tụ của từng cặp chủng vi khuẩn: Mỗi chủng vi
khuẩn lấy 20 ml dịch huyền phù đã chuẩn bị ở trên (tỷ lệ 1:1) cho vào bình tam
giác có dung tích 150 ml, đặt trên máy lắc có tốc độ 120 vòng/phút, ở nhiệt độ
30oC, lắc liên tục trong thời gian xác định ở thí nghiệm 3.4.5, tiến hành đo OD và
tính hiệu suất đông tụtheo phương pháp (Kimchhayarasy et al. 2009) giống như thí
nghiệm 3.4.5 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.2 Xác định yếu tố cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ trong môi trường ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ hưởng đến hiệu suất đông tụ
a. Mục đích: xác định được nồng độ và loại cation thích hợp trong môi trường để vi khuẩn đông tụ hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt trên từng nhân tố cation [4 loại cation là Ca2+, Mg2+, K+, Na+ (với các mức nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM)], 3 lần
c. Thực hiện: chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan lần lượt trong các dung dịch muối CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl ở lần lượt các nồng độ 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 mM cho mỗi
lần thực hiện thí nghiệm. pH được điều chỉnh giá trị phù hợp nhất được ghi nhận ở
thí nghiệm 3.4.6.1, các bước tiếp theo tiến hành giống như thí nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.3 Phối hợp cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp có trong môi trường để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ cao nhất
a. Mục đích: chọn được cặp cation (hóa trị 1 + hóa trị 2) phù hợp nhất để vi
khuẩn đông tụ hoạt động với hiệu suất cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 04 cặp cation (hóa trị
1 và hóa trị 2 mức nồng độ phù hợp nhất ở thí nghiệm 3.4.6.2, 3 lần lặp lại.
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 4 x 3 = 48
c. Thực hiện: Chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan lần lượt trong từng cặp dung dịch muối
cation hóa trị 1 và hóa trị 2 [CaCl2 + NaCl; CaCl2 + KCl; MgCl2 + NaCl; MgCl2 + KCl (tỷ lệ 1:1)]. Nồng độ cation của mỗi loại muối được chọn ở thí nghiệm
3.4.6.2. Phối hợp từng cặp chủng vi khuẩn và tính hiệu suất đông tụ giống như thí
nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.6.4 Xác định yếu tố phối hợp pH và cặp cation trong môi trường có giá trị phù hợp để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ tốt nhất hợp để vi khuẩn hoạt động cho hiệu suất đông tụ tốt nhất
a. Mục đích:Xác định tính tương quan giá trị pH và nồng độ cation hóa trị 1
và hóa trị 2 trong môi trường phù hợp nhất để vi khuẩn động tụ hoạt động cho hiệu
suất cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 2 nhân tố [pH, cặp
cation (Mg2++K+)], với 3 lần lặp lại.
+ Nhân tố thứ nhất: pH môi trường thực hiện ở các giá trị 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0
+ Nhân tố thứ hai: Cặp cation được chọn ở thí nghiệm 3.4.6.3 (A1+A2) với
các mức nồng độ của từng loại cation hóa trị 2 là:10 mM, 20 mM, 30 mM; cation hóa trị 1 là: 20 mM, 30 mM, 40 mM được xác định ở thí nghiệm 3.4.6.2
Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 4 x 9 x 5 x 3 = 540
c. Thực hiện: Chuẩn bị dịch vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.4.5, nhưng giai đoạn thu sinh khối, rửa và hòa tan trong dung dịch muối của cặp cation (A1+ A2) (tỷ lệ 1:1) với các nồng độ được phối hợp ngẫu nhiên của hai loại muối lần
lượt ở các nồng độ (A2.10 + A1.20; A2.10 + A1.30; A2.10 + A1.40; A2.20 + A1.20; A2.20 + A1.30; A2.20 + A1.40; A2.30 + A1.10; A2.20 + A1.20; A2.30 + A1.30 mM).
pH được điều chỉnh lần lượt ở các mức 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 cho mỗi lần thực hiện
thí nghiệm ở mỗi cặp cation. Phối hợp từng cặp chủng vi khuẩn và tính hiệu suất đông tụ giống như thí nghiệm 3.4.6.1 cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm.
3.4.7 Xác định tỷ lệ giống vi khuẩn đông tụ ứng dụng xử lý nước thải
a. Mục đích: nhằm xác định liều lượng giống vi khuẩn đông tụ được bổ
sung phù hợp nhất để xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas cho hiệu suất đông
tụ cao nhất
c. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 04 cặp chủng vi khuẩn riêng biệt được khảo sát với 1 nhân tố (liều lượng
giống vi khuẩn ở các tỷ lệ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1%), 01 nghiệm thức đối chứng dương (bổ sung 0,05% PAC, không bổ sung vi
khuẩn); 01 nghiệm thức đối chứng âm (không bổ sung PAC và vi khuẩn), với 3 lần
lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm : 12 x 4 x 3 = 144
c. Thực hiện: 04 cặp chủng vi khuẩn đông tụ được chọn ở thí nghiệm 3.4.5,
tiến hành kiểm tra hiệu suất đông tụ của mỗi cặp chủng vi khuẩn khi bổ sung lượng vi khuẩn lần lượt với các tỷ lệ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1% cho mỗi lần thực hiện thí nghiệm. Quy trình kiểm tra hiệu suất đông tụ ở mỗi cặp chủng vi khuẩn đông tụ như sau:
- Lấy 36 bình tam giác loại 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 100 ml nước
thải chăn nuôi heo sau biogas.
- Chỉ số pH và muối kim loại được chọn ở mức tối ưu theo kết quả các thí nghiệm tương ứng ở trên.
- Bổ sung 0,05% PAC và dung dịch cặp chủng vi khuẩn (tỷ lệ 1:1) vào mỗi
bình lần lượt với các liều lượng 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1 % (mật độ vi khuẩn lớn hơn hoặc bằng 109 CFU/ml). Mẫu đối chứng dương
không bổ sung vi khuẩn, mẫu đối chứng âm không bổ sung vi khuẩn và PAC (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2010; trích từ Gong et al., 2008).
- Đặt trên máy lắc 120 vòng/phút trong 6 giờ; để yên 18 giờ; lấy phần trong
cách mặt nước 2 - 3 cm của mỗi bình đem đo OD660nm; tính hiệu suất đông tụ theo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
công thức ở thí nghiệm 3.4.5
3.4.8 Ứng dụng vi khuẩn đông tụ vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas quy mô phòng thí nghiệm và trại chăn nuôi heo
a. Mục đích: nhằm xác địnhđược hiệu suất đông tụ của vi khuẩn trong xử lý