L ời cam đoan
2.11 Sự đông tụ hình thành màng sinh học trong xử lý nước thải
Từ khi phương pháp sinh học ứng dụng xử lý nước thải được nhiều người chú ý, đã có nhiều nghiên cứu đặc biệt quan tâm về cấu trúc của màng vi sinh vật trong xử lý nước thải. Theo thời gian và sự phát triển của công cụ nghiên cứu, cấu trúc của màng vi sinh vật ngày càng được sáng tỏ và là cơ sở để mô hình hóa những quá trình sinh học xảy ra bên trong màng. Màng vi sinh vật có cấu trúc rất phức tạp cả về cấu trúc vật lý và vi sinh. Cấu trúc cơ bản của màng vi sinh vật là:
(a) 4,5; (b) 10; (c) 19; (d) 26; (e) 35; (f) 55; (g) 120 [giờ]
(i) Vật liệu đệm (đá, sỏi, chất dẻo, than… với nhiều kích cỡ khác nhau) có bề
mặt rắn làm môi trường dính bám cho vi sinh vật.
(ii) Lớp màng vi sinh vật phát triển dính bám trên bề mặt vật liệu đệm. Lớp
màng vi sinh (microbial films) được chia thành hai lớp: lớp màng nền (base film) và lớp màng bề mặt (surface film).
Cấu tạo của lớp màng vi sinh vật bao gồm những tế bào vi sinh vật kết dính
đan xen nhau với một số vật chất khác lơ lửng trong môi trường, mối liên kết này
được cấu tạo bởi các polymer ngoại bào, do vi sinh vật sản sinh ra trong quá trình
trao đổi chất, quá trình tiêu hủy tế bào và do có sẵn trong nước thải. Thành phần chủ yếu của các polymer ngoại tế bào này là polysaccharide, protein (Hình 2.12)
Hình 2.12: Sự hình thành màng sinh học từ sự tự đông tụ
(Pereira et al., 2010)
Trước đây, khi nghiên cứu màng vi sinh thường không quan tâm nhiều tới vai
trò của bề mặt lớp màng mà chỉ chú ý tới lớp màng nền. Nhờ sự phát triển của các
công cụ mới để nghiên cứu màng vi sinh, những hình ảnh mới về cấu trúc của lớp
màng nền dần được xác định. Những phát hiện mới cho thấy, màng vi sinh là một
cấu trúc không đồng nhất bao gồm những cụm tế bào rời rạc bám dính với nhau trên bề mặt đệm, bên trong cấu trúc này là polymer ngoại bào, trong màng vi sinh vật tồn
tại những khoảng trống giữa các cụm tế bào theo chiều ngang và chiều dọc. Những
khoảng trống này có vai trò như những lổ rỗng theo chiều dọc và như những kênh vận chuyển theo chiều ngang. Kết quả là sự phân bố sinh khối trong màng vi sinh
không đồng nhất. Quy luật chung trong sự phát triển của màng vi sinh vật bởi quá
trình tiêu thụ cơ chất có trong nước thải và làm sạch nước thải là quá trình vi sinh vật phát triển bám dính trên bề mặt đệm được chia làm 3 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất có dạng logarithm, khi màng vi sinh vật còn mỏng và
chưa bao phủ hết bề mặt rắn. Trong điều kiện này tất cả vi sinh vật phát triển như
nhau, cùng điều kiện sự phát triển giống như quá trình vi sinh vật lơ lửng.
Giai đoạn thứ hai, độ dày màng trở nên lớn hơn bề dày hiệu quả. Trong giai đoạn này tốc độ phát triển là hằng số, bởi vì bề dày lớp màng hiệu quả không thay đổi bất chấp sự thay đổi của toàn bộ lớp màng và tổng lượng vi sinh đang phát
triển cũng không đổi trong suốt quá trình này. Lượng cơ chất tiêu thụ chỉ dùng để
duy trì sự trao đổi chất của vi sinh vật không có sự giatăng sinh khối.
Giai đoạn thứ ba, bề dày lớp màng trở nên ổn định, khi đó tốc độ phát triển
màng cân bằng với tốc độ suy giảm bởi sự phân hủy nội bào. Vi khuẩn đông tụ có
vai trò rất lớn trong việc hình thành màng sinh học để xử lý nước thải.
Hình 2.13: Sự hình thành màng sinh học (Min và Rickard (2009)
(a): Các tế bào tương đồng dính nhau trực tiếp qua chất nền; (b) Các tế bào tương đồng được bao bởi lớp màng tế bào; (c): Các tế bào đơn khác dính với các nhóm tế bào qua lớp màng tế bào; (d):
Tất cả nhóm tế bào liên kết lại bởi lớp màng sinh học hoàn chỉnh
Theo Saginur et al. (2006) vai trò tạo sự đông tụ của vi khuẩn là yếu tố cần
thiết cho sự hình thành màng sinh học, sự đông tụ góp phần tham gia vào quá trình hình thành và phát triển màng sinh học, bước đầu tiên là sự kết dính của tế bào đơn trong môi trường đến bề mặt vật liệu. Sau đó chủ yếu là sự đông tụ, từ các tế bào
đơn lẻ hoặc từ một nhóm các tế bào khác nhau hoặc một nhóm các tế bào giống
nhau về mặt di truyền sẽ kết dính với những tế bào kết dính với bề mặt vật liệu trước đó. Quá trình này được tiếp diễn và tạo thành màng sinh học đa chủng vi sinh
vật. Min và Rickard (2009) đã chứng minh rằng, sựđông tụtăngcườngđộ bám dính giữa các màng sinh họcnước ngọt phù du, vi khuẩn nó có khảnăngđóng góp vào sự
phát triển của màng sinh học trong môi trường tĩnh hay chảy (Hình 2.13).
2.12 Nhận diện, định danh vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân tử
Định danh vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống: dựa trên các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa, sinh thái và hình thái vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2012)
Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử: ngày nay, với sự
phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại việc định danh vi sinh vật dựa vào vật
liệu di truyền cho kết quả rất nhanh và chính xác (Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ
Phân tích dựa trên trình tự 16S rRNA của gen là một trong những phương pháp xác định, phân loại vi khuẩn có độ chính xác cao. 16S rRNA là một thành phần của 30S tiểu đơn vị nhỏ của ribosome sinh vật nhân sơ. Các gen này bảo tồn
cao giữa các loài khác nhau của vi khuẩn và vi khuẩn cổ , rRNA ti thể và lục lạp
(Woese et al., 1977).
Trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ, ty thể và lục lạp, tiểu đơn vị nhỏ của ribosome chứa 16S rRNA, tiểu đơn vị lớn chứa 2 loại rRNA, 5S và 23S. Ở tế bào nhân sơ, 5S được nghiên cứu mạnh nhưng nó khá nhỏ (từ 100 đến 120 nucleotide) để suy ra
hệ thống phát sinh chính xác. Trong khi 16S rRNA (~1500 nucleotide) và 23S
rRNA (~2900 nucleotide) đủ lớn để sử dụng cho mục đích này. Tế bào vi khuẩn
cần rất nhiều ribosomal RNA, vì vậy chúng thường có nhiều bản sao của
ribosomal RNA operon, các operons nằm ở các phần khác nhau của genome không
liên kết với nhau (Hình 2.14).
Hình 2.14: Ribosomal RNA operon của E.coli
(http://sandwalk.blogspot.com/2008/01/ribosomal-rna-genes-in-bacteria.html)
Phân tử 16S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng mối quan hệ loài, là công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật, vì trong rRNA có một số
trình tự có tính bảo tồn cao. Nguyên lý của việc xây dựng mối quan hệ loài là dựa
vào những thay đổi (đột biến) trên vùng bảo tồn của rRNA. (hoặc giữa các loài trong cùng một chi - genus). Trình tự này tuy bảo tồn nhưng vẫn phải đáp ứng yêu cầu là có sự đa dạng nhất định, đồng thời phải có độ dài vừa phải, nhưng vẫn chứa đựng đủ thông tin di truyền. Thông thường, người ta dùng trực tiếp trình tự rDNA
hoặc là rRNA (tiểu phần 16S đối với sinh vật nhân sơ; 5S, 18S hoặc 28S đối với
sinh vật nhân thật).Do đó các gen mã hóa cho rRNA được sử dụng rộng rãi trong phân loại, phân tích mối quan hệ di truyền và đánh giá tỉ lệ khác biệt loài của vi
khuẩn. Việc so sánh trình tự 16S rRNA có thể cho thấy quan hệ tiến hóa của vi
sinh vật.
Trình tự 16S rRNA có các vùng biến thiên mạnh, nơi các trình tự thay đổi
trong quá trình tiến hóa. Trình tự 16S rRNA được xác định cho rất nhiều loài và
được lưu trữ trên ngân hàng gen (Genbank) hay cơ sở dữ liệu (NCBI).
Việc sử dụng các trình tự gen 16S rRNA để nghiên cứu mối quan hệ loài, phân loại và là dấu hiệu (marker) di truyền được sử dụng rộng rãi nhất do: nó có trong hầu
hết các loại vi khuẩn, thường tồn tại như một họ đa gen hoặc operons; chức năng của
ngẫu nhiên là thước đo chính xác hơn của sự tiến hóa (thời gian); trình tự 16S rRNA
đủ lớn cho các phân tích thông tin (Janda và Abbott, 2007). Đặc biệt đối với 16S rRNA được xem là trình tự đánh dấu đặc sắc, chúng được sử dụng rộng rãi và thành công trong việc xác định và phân loại vi khuẩn, do các chức năng của chúng ổn định. Từ đó, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các
vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết và chính xác hơn.
Trình tự 16S rRNA dài khoảng 1.500 bp và có cả vùng bảo tồn và vùng biến động. Trình tự 16S rRNA đủ dài với các vùng đa hình bên trong có khả năng để
phân biệt và đánh giá thống kê. Cặp mồi chung được thiết kế bổ sung cho vùng bảo tồn của gen và trình tự của vùng biến động được sử dụng để so sánh phân loại.
Trình tự 16S rRNA đã được xác định cho rất nhiều chủng. Trong cơ sở dữ liệu
trình tự nucleotide lớn nhất ở GenBank, có hơn 142 triệu trình tự, trong đó hơn 3
triệu là của trình tự16S rRNA. Điều đó có nghĩa rất nhiều trình tự đã có sẵn để so
sánh với trình tự của chủng chưa được biết. Cuối cùng, trình tự 16S rRNA là chung cho vi khuẩn, vì vậy quan hệ họ hàng có thể được xác định giữa tất cả các
loại vi khuẩn. Nói chung, so sánh trình tự 16S rRNA cho phép phân biệt các cơ thể ở mức độ giống, loài hoặc dưới loài.
Một trong những tiềm năng hấp dẫn của việc sử dụng các thông tin trình tự
gen 16S rRNA, là nó cung cấp sự định danh giống và loài cho các chủng phân lập, có các tính chất hóa sinh không trùng với bất kỳ tính chất nào đã được biết, cho
các chủng chỉ định danh được ở mức độ “chấp nhận được” hoặc “có khả năng”
theo các hệ định danh thương mại. Các kết quả nghiên cứu tích lũy cho đến nay
thấy rằng, giải trình tự gen 16S rRNA hơn 90% có thể định danh đến giống, đến
loài thấp khoảng 65 − 83%, và còn khoảng 1 − 14% các chủng phân lập không định danh được. Những khó khăn gặp phải trong quá trình định danh đến giống
hoặc loài là sự nhận biết taxa mới, quá ít trình tự gen có trong Genbank, các chủng
có những trình tự 16S rRNA tương tự hoặc giống nhau, hay vấn đề danh pháp từ
nhiều genomovars qui cho một loài hoặc một phức hợp. Phần lớn các nghiên cứu
kết luận rằng trình tự 16S rRNA cho tỉ lệ định danh loài cao, từ 62 - 91% (Janda và Abbott, 2007).
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng tổng hợp dây
chuyền DNA trong ống nghiệm trên cơ sở hoạt động của những chu kỳ nối tiếp
nhau, với sự có mặt của 2–3 đoạn mồi (primer) chuyên biệt. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000
bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ các đoạn mồi đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Những đoạn DNA sau khi khuếch đại sẽ quan sát dưới tia cực tím, sau khi chạy điện di trong gel agarose 0,3% – 3% có chứa dung dịch ethidium bromide. Trước đây người ta sử dụng DNA polymerase của E.coli cho phản ứng PCR,
nhưng enzym này rất mẫn cảm với nhiệt độ nên dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao, do
đó cần phải bổ sung enzym này vào sau mỗi chu kỳ luân nhiệt. Hiện nay các nhà nghiên cứu sử dụng Taq-polymerase thay cho DNA polymerase của E.coli vì enzym này hoạt động và bền với các điều kiện nhiệt độ cao.
Kỹ thuật giải trình tự đoạn DNA (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định tất
cả các hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chuyên tính nào đó.
Khả năng đọc được chuỗi mã gắn liền với nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh
học phát triển. Những kỹ thuật “sequencing” cũng chỉ mới được hoàn thiện trong
những năm gần đây. Đặc biệt với sự trợ giúp của máy tính kỹ thuật huỳnh quang,
tiến bộ của PCR,… kỹ thuật sequencing trở thành công cụ rất có giá trị làm nền
tảng cho phân tích gen (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Trình tự DNA được giải bằng máy giải trình tự ABI và kết quả giải trình tự 16S rRNA được so sánh với trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác có ở ngân
hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm BLAST N. Trình tự các chủng khảo sát được
so sánh bằng chương trình CLUSTAL 1.6 và sơ đồ mối quan hệ di truyền được
xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining trong chương trình MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011). Xác định mối quan hệ gần gũi các chủng vi khuẩn phân lập
dựa trên loài gần nhất của sơ đồ quan hệ di truyền. Phân loại và xếp lớp vi khuẩn
dựa trên Bergey’s Manual of determinative Bacteriology, 2nd edition (New York: Springer) (Garrity, 2005).
Để thực hiện quá trình định danh vi khuẩn phân lập, bằng phương pháp sinh
học phân tử có thể thực hiện theo sơ đồ (Hình 2.15).
Hình 2.15: Sơ đồ phân tích mối tương quan di truyền
và định danh vi khuẩn phân lập, bằng phương pháp sinh học phân tử 2.13 Đa hình trình tự Nuleotide
Đa hình nucleotide (SNP) là một sự biến thiên nucleotide tại một điểm riêng biệt trong hệ gen. Hình 2.16, cho thấy có 4 SNPs (A/G, C/T, G/A và C/G/T) được
tìm thấy, trong đó A/G, C/T và G/A là dạng SNPs 2 alen và C/G/T là dạng SNPs 3 alen. Về mặt lý thuyết, 4 dấu SNPs trên có thể tạo ra được 24 kiểu haplotype trong
Tách chiết DNA
Khuếch đại gen 16S bằng kỹ thuật PCR
Kiểm tra sản phẩm PCR điện di trên gel
Làm sạch sản phẩm PCR Giải trình tự sản phẩm PCR Phân tích trình tự DNA Xây dựng mối tương quan trình
tự 16S rRNA của vi khuẩn Định danh
24 trình tự chuỗi nhưng chỉ xét 6 trình tự chuỗi xác định được 5 haplotype do trình tự chuỗi thứ 3 và 6 có dạng haplotype trùng nhau.
Hình 2.16 Đa hình đơn nucleotide (SNPs)có 5 haplotype trong 6 trình tự chuỗi
(Nguồn: The International HapMap Consortium, 2003)
Thông thường, SNPs là 2 alen và được xác định ở mức 1% trong quần thể
(Wang et al., 1998). Giá trị của SNPs 3 hoặc 4 alen, chèn thêm, mất và các biến
thể được tìm thấy nhỏ hơn 1% trong quần thể cũng được gọi là SNPs. SNPs là các biến thể phong phú nhất trong hệ gen (The International HapMap Consortium,
2003 và The International HapMap Consortium, 2005). Dự án HapMap quốc tế đã
được đặc trưng trên SNPs bộ gene người 3,1 triệu chỉ số SNPs, cho thấy mật độ
SNPs khoảng một kilobase (The International HapMap Consortium, 2007).
Chỉ số đa hình trình tự chuỗi nucleotide () được tính theo phương pháp mô
tả bởi Halushka et al., (1999) sử dụng phần mềm DNAsp5 xác định chỉ số di
truyền SNPs kết hợp với phần mềm BioEdit của Hall (1999).
= K/aL n i i a 2 ) 1 /( 1
Trong đó K là số SNPs xác định trong một thời gian liên kết, a là alen và L là tổng chiều dài của chuỗi (bp).
Các kiến thức về chức năng của gen có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc kỹ thuật
di truyền cho các ứng dụng công nghệ sinh học. Ngoài ra, chức năng của gen còn giúp các nhà nghiên cứu xác định gen để phân tích SNPs. Các chỉ thị phân tử liên kết với sự xác định một kiểu hình cũng có thể được sử dụng trực tiếp như đánh dấu
chọn lọc cho sự phát triển nhanh chóng trong công nghệ sinh học. Phát hiện các
biến thể di truyền có tiềm năng lớn để làm sáng tỏ các cơ chế phân tử và hiểu sâu hơn về gen chức năng cho các ứng dụng công nghệ sinh học.
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 06/2012 - 08/2014 tại Viện Nghiên cứu và phát triển
Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Ứng dụng xử lý nước thải chăn
nuôi heo sau biogas quy mô 80 và 800 lít tại trại chăn nuôi heo Lê Hoàng Minh, ấp Đông Hưng 2, xã Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
3.2 Sơ đồ nghiên cứu
3.3 Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất 3.3.1 Nguyên liệu
Một trăm năm mươi mẫu nước thải chăn nuôi heo sau biogas (nước thải lẫn
chất thải rắn) được thu tại 150 hầm hoặc ao chứa nước thải từ sau hệ thống biogas