L ời cam đoan
3.2.Sơ đồ nghiên cứu
3.3 Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất 3.3.1 Nguyên liệu
Một trăm năm mươi mẫu nước thải chăn nuôi heo sau biogas (nước thải lẫn
chất thải rắn) được thu tại 150 hầm hoặc ao chứa nước thải từ sau hệ thống biogas ở trại chăn nuôi heo của 52 huyện/thị thuộc 13 tỉnh/thành phố khu vực đồng bằng
sông Cửu Long (Bảng 3.1). Mỗi mẫu nước thải được thu nhận sau mỗi túi biogas
khác nhau và túi biogas được lắp đặt từ 12 đến 36 tháng, các trại chăn nuôi heo đều đang hoạt động, mỗi trại có từ 50 – 2.000 con heo thịt 3 – 4 tháng tuổi. Địa điểm
chọn thu mẫu là nơi không biểu hiện vi khuẩn kết tụ sinh học (từ kết quả phân lập
vi khuẩn kết tụ sinh học của nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Tiền năm 2011 tại Viện
nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ). Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đông tụ
Định danh vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử
Ứng dụng vi khuẩn đông tụ xử lý nước thải chăn nuôi heo
sau biogas quy mô phòng thí nghiệm và trại chăn nuôi heo Quan sát đặc tính khuẩn lạc,
đặc điểm vi khuẩn, nhuộm
Gram, kiểm tra sinh hóa
Tuyển chọn vi khuẩn đông
tụ thông qua tính kỵ nước
của bề mặt tế bào vi khuẩn
Xác định cơ chế đông tụ: Tự đông tụ và đồng đông tụ Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông tụ [pH,
cation (Ca2+, Mg2+, K+, Na+), liều lượng vi khuẩn] Nước thải chăn nuôi heo sau biogas sau
Bảng 3.1: Thông số ban đầu mẫu nước thải chăn nuôi heo sau biogas
STT Địa điểm thu mẫu (tỉnh/TP) Tổng số mẫu Ký hiệu pH
1 An Giang 11 AG01 AG11 6,5 – 8,3
2 Bạc Liêu 06 BL01 BL06 6,0 – 7,6 3 Bến Tre 14 BT01 BT14 6,1 – 7,8 4 Cà Mau 14 CM01 CM14 6,5 – 7,4 5 Cần Thơ 11 CT01 CT11 6,1 – 7,2 6 Đồng Tháp 7 DT01 DT07 6,2 – 7,1 7 Hậu Giang 11 HG01 HG11 6,8 – 8,0 8 Kiên Giang 21 KG01 KG21 6,5 – 8,7
9 Long An 06 LA01 LA06 6,4 – 7,1
10 Sóc Trăng 14 ST01 ST14 6,6 – 8,0
11 Tiền Giang 20 TG01 TG20 6,2 – 7,3
12 Trà Vinh 07 TV01 TV07 6,6 – 7,6
13 Vĩnh Long 08 VL01 VL08 6,0 – 8,5
Tổng cộng 150
Cách thu mẫu: nước thải trong hầm hoặc ao chứa từ túi biogas thải ra, được
khuấy lên, tay mang găng, dùng ca nhựa 250 ml thu phần nước thải ở độ sâu 20 – 30 cm, cho vào chai nhựa 100 ml bịt kín lại mang về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ 3 đến 5oC (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002; Trần LinhThước, 2007), (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu được đo pH, mật độ vi khuẩn và tiến hành trải mẫu ngay trong 48 giờ kể từ khi mẫu được thu về phòng thí nghiệm (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2006).
Hai trăm hai mươi tám lít nước thải ứng dụng tại phòng thí nghiệm và 3.840
lít nước thải ứng dụng tại trại chăn nuôi heo được thu ở ao số 2, chứa nước thải sau
biogas (túi biogas được lắp đặt từ 24 – 36 tháng) của trại chăn nuôi heo 2000 con
heo thịt, Lê Hoàng Minh, ấp Đông Hưng 2, xã Đông Thành, huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long. Cách thu nước thải để ứng dụng tương tự như thu mẫu và được sử
dụng với phương tiện phù hợp.
3.3.2 Thiết bị
- Máy Barnstead (Mỹ): cất nước vô trùng
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – International (Ý): tiệt trùng dụng cụ và môi
trường thí nghiệm trước khi thực hiện thí nghiệm.
- Tủ cấy vi sinh vật Esco Class II BSC – Model: AC2-4E1 (Pháp): thực hiện vô trùng để cấy chuyền vi khuẩn
- Tủ ủ vi sinh vật Binder Incubator–9010-0081 (Mỹ): ủ vi khuẩn trong điều kiện nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phát triển
- Máy lắc mẫu New brunswick Scientific - Excella E24 – MI352-0002 (Mỹ): giữmôi trường nhân nuôi vi khuẩn luôn động giúp vi khuẩn phát triển đều, nhanh.
- Tủ lạnh giữ mẫu Hitsuji – model: HI318HBB (Nhật): lưu giữ mẫu vi khuẩn
trong điều kiện phù hợp.
- Cân điện tử Shimadzu – UX420S (Nhật): cân các loại hóa chất để thực hiện thí nghiệm (đơn vị mg).
- Máy đo pH Cyber Scan pH510 – EC-PH5-TEMB01P (Mỹ): chuẩn pH môi
trường hoặc đo pH mẫu.
- Máy khuấy từ Yellow Mag MS7 (Đức): trộn đều, khuấy tan hóa chất trong môi trường khi cần thiết.
- Máy vortex IKA – SA 07H1724 (Mỹ): trộn đều dịch vi khuẩn với môi
trường trong ống nghiệm.
- Quang phổ kế (đo OD) Thermo Scientific – Genesys 10-s (Mỹ): đo độ đục của mẫu thí nghiệm.
- Máy ly tâm Eppendorf Concentrator – 5417R (Đức): thu sinh khối vi khuẩn. - Lò vi sóng LG –MEZ61914101 (Hàn Quốc): làm lỏng môi trường agar. - Tủ sấy EHRET (Đức): sấy khô thiết bị thí nghiệm và giữ lỏng môi trường. - Kính hiển vi quang học Olympus CHT (Nhật): quan sát hình thái vi khuẩn. - Kính hiển vi điện tử quét – SEM ( Nhật): quan sát hình thái vi khuẩn ở độ phóng đại cao.
- Máy ly tâm chân không Eppendorf Concentrator – 5310 (Đức): làm khô mẫu bằng phương pháp hút chân không.
- Máy ủ nhiệt ấm TYB – 1083 (Đức): giữấm mẫu ở nhiệt độ cần thiết để tiến
hành các bước cần thiết trong tách chiết DNA.
- Máy so màu quang phổ Beckman Counter – DU640B (Mỹ): kiểm tra độ
tinh sạch DNA trong thao tác tách chiết DNA
- Máy PCR Biorad– C1000 Thermal Cycler (Mỹ): chạy PCR sản phẩm DNA qua các chu kỳđược thiết kế phù hợp.
- Bộ điện di một chiều 90V Biorad SGE-014-02 (Mỹ): xác định băng điện di trên agarose. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy đọc và chụp hình gel-Rad Universal Hood II (Mỹ): chụp hình gel để xác định băng trên gel tương ứng với độ dài trình tự 16S rRNA của vi khuẩn.
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu (Việt Nam): lưu trữ và xử lý thống kê số liệu thí nghiệm.
- Máy bơm nước 0,5 KV (Việt nam): bơm nước từao nước thải lên các thiết bịđể xử lý nước thải.
- Máy sục khí ResunAirpump – Aco-008 - Công suất 0,9 m3/phút (Trung Quốc): trộn đều dịch vi khuẩn và cung cấp oxy cho môi trường trong quá trình ứng dụng xử lý nước thải bằng vi khuẩn đông tụ.
3.3.3 Dụng cụ
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000. - Bình tam giác loại 1000 ml, 500 ml, 250 ml, 150 ml.
- Đĩa Petri, ống nghiệm các loại; Ống giữ mẫu (8 ml, 12 ml). - Bình nhựa 10 lít; xô nhựa 100 lít; bể nhựa 1000 lít.
3.3.4 Hóa chất
- Hóa chất dùng phân lập, tuyển chọn vi khuẩn đông tụ và tối ưu hóa môi trường
Polypepton (Merck – Germany), (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, MgSO4, CaCl2, FeCl3, K2HPO4, KCl, CaCl2, MnSO4, Al2(SO)4, NaOH, HCl, (NH4)2SO4, p-xylen (Merck – Germany), agar.
Muối sử dụng trong kiểm tra cation: CaCl2, MgCl2, NaCl, KCl. Dung dịch chuẩn pH: acid acetic, NaOH.
H2O2 3%: thử khả năng sản sinh ra catalase của vi khuẩn.
- Hóa chất dùng trong quá trình ly trích DNA vi khuẩn
TE pH 8; Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%; Proteinase K (20mg/ml); Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75M; Chloroform: isoamylalcohol (24:1); Isopropanol; Ethanol 70%; nước cất hai lần vô trùng (BiH2O).
- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR
PCR buffer (Mỹ); Taq DNA polymerase; DNA vi khuẩn đông tụ; dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); BiH2O; Cặp mồi: Mồi xuôi (8F) và mồi ngược
(1492R) Zhao et al., (2010) ; MgCl2.
- Hóa chất dùng trong điện di
Agarose (Merck – Germany); TAE buffer (dung dịch đệm TAE); Loading buffer (chất chỉ thị màu – LB); Ethidium bromide (EtBr); Thang chuẩn DNA 100bp plus.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phân lập, khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa và định lượng vi khuẩn từ nước thải chăn nuôi heo sau biogas nước thải chăn nuôi heo sau biogas
3.4.1.1 Phân lập, quan sát hình thái và sinh hóa
Môi trường Polypepton phân lập vi khuẩn đông tụ(Kimchhayarasy et al., 2009) Polypepton: 10 g; (NH4)2SO4: 1 g; NaNO3: 0,5 g; NaCl: 0,1 g; MgSO4·7H2O: 0,2 g; CaCl2·2H2O: 0,05 g; FeCl3·6H2O: 0,01 g ; K2HPO4: 1 g; nước: 1 lít; pH: 7.
Quy trình phân lập, quan sát hình thái, đo kích thước vi khuẩn, quan sát
khuẩn lạc, nhuộm Gram vi khuẩn và trữ mẫu thuần, thực hiện theo quy trình của; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, (2000); Nguyễn Đức Lượng và ctv., (2006); Trần Linh Thước, (2007).
Một ml mẫu nước thải được pha loãng với 99 ml nước cất đã khử trùng, cho vào bình tam giác 250 ml → pha loãng 102; 1 ml độ pha loảng 102 + 9 ml nước cất
cho vào ống nghiệm 20 ml → pha loãng 103; 1 ml độ pha loảng 103 + 9 ml nước
cất cho vào ống nghiệm 20 ml → pha loãng 104. Mỗi độ pha loãng lấy 20 µl trãi
đều trên môi trường thạch polypepton , ủ trong 24 – 48 giờở 30oC.
Tách thuần từng khuẩn lạc bằng cách cấy chuyển tiếp sang môi trường thạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vài lần quan sát thấy khuẩn lạc rời đều, chọn khuẩn lạc tách rời trên đường cấy, khuẩn lạc có bề mặt trơn, nhầy và ướt được tách chuyển ra ống trữ nghiêng. Kết
hợp kiểm tra thuần trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần, quan sát sự tương đồng hình dạng của vi khuẩn, để chọn một chủng riêng biệt. Mỗi chủng được quan sát đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào, khả năng chuyển động và nhuộm Gram vi khuẩn.
Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc: cấy chuyền vi khuẩn trên môi
trường thạch, sau 24, 36, 48 giờ nuôi, đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet
và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường.
Quan sát hình thái và khả năng chuyển động của vi khuẩn: sau khi phân lập
và tách thuần vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi
khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở thị kính 10x, vật
kính 40x. Nhỏ 20 μl nước cất vô trùng lên lam kính; khử trùng kim cấy trên ngọn
lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lam kính; đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn. Tiến hành quan sát mẫu, ghi nhận hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần. Quan sát hình thái, kích thước vi khuẩn bằng kỹ thuật chụp
hình dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm kép của Schaefea và Fulton theo quy trình nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus cereus (Nguyễn Đức Lượng
và ctv., 2006).
Nhuộm Gram vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram của Christian Gram
theo quy trình nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus cereus (Trần Linh Thước, 2007).
Phép thử khả năng sản sinh ra catalase theo quy trình của Andretta et al.
(2004): nhỏ giọt H2O2 3% lên đĩa khuẩn lạc. Sau 1 – 2 giây quan sát, nếu có bọt
3.4.1.2 Bảo quản, cấy chuyền và nhân giống
- Bảo quản mẫu thuần: các chủng vi khuẩn đã thuần đem cấy trữ mẫu trong
ống chứa môi trường phân lập vi khuẩn (trữ 3 ống), bảo quản trong tủ lạnhở nhiệt độ từ 7 - 8oC (có thể trữ được 3 tháng, sau đó tiếp tục cấy chuyền). Các chủng vi
khuẩn đã phân lập ròng được cất trữ trong glycerol 20%, ở nhiệt độ từ -20oC đến - 70oC có thể trữ được trong thời gian 2 đến 3 năm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu
Hiệp, 2002), (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2006).
- Cấy chuyền nhân giống: dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm thuần từống nghiệm thạch nghiêng đang lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới (môi
trường phân lập). Đểống nghiệm trong tủấm, nuôi ủở 30oC trong 24 giờ.
+ Nhân giống cấp 1: hút 1 ml nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn, lắc đều. Hút 100 l dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
+ Nhân giống cấp 2: xác định mật độ trong giống cấp 1 theo thời gian. Khi mật độ vi khuẩn trong giống cấp 1 đến giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyền tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy ủ lắc, vận tốc 120 vòng/phút, ở
nhiệt độ 30oC. Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn được vệ
sinh sạch và dùng máy sục khí với tốc độ phù hợp để thay cho máy lắc. Kiểm tra mật độ vi khuẩn đạt >109 CFU/ml thì sử dụng được (Trần Linh Thước, 2007).
3.4.1.3 Định lượng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt của Hoben
và Somasegaran, (1982) thực hiện theo quy trình (Hình 3.1)
Công thức tính mật độ vi khuẩn: Số khuẩn lạc/ml = A × 100 × B A: là số khuẩn lạc đếm được trung bình của 5 giọt (số khuẩn lạc /10 µl)
B: Mức độ pha loãng
100: Hệ số chuyển từ 10 µl đến ml
3.4.2 Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh hóa
a. Mục tiêu: chọn được những chủng vi khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao
thông qua hiệu suất hấp thụ của p-xylen với vi khuẩn (chọn chủng vi khuẩn có hiệu
suất >50%) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
b. Bố trí thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập thuần ở thí nghiệm trước
(124 chủng) được thực hiện theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng
số đơn vị thí nghiệm 124 x 3 = 372.
c. Thực hiện: kiểm tra sinh hóa 124 chủng vi khuẩn đông tụ với dung môip-
xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ được xác định dựa trên hiệu suất hấp thụ của p-xylen với tế bào vi khuẩn theo phương pháp của Rosenberg
et al., (1980). Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi trong 20 ml môi trường polypepton
lỏng (môi trường phân lập) trong ống falcon, ủ trên máy lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, trong 48 giờ, lấy 10 ml dịch vi khuẩn ly tâm 11.000 vòng/phút trong 10
phút để lấy sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được rửa 2 lần với dung dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2), sinh khối được hòa tan, chứa trong 10 ml dung
dịch muối (3 mM NaCl + 0,5 mM CaCl2) ở ống nghiệm thứ nhất. Lấy 5 ml dịch
huyền phù từ ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai cùng với 5 ml
p-xylen, trộn đều dịch huyền phù với p-xylen bằng máy vortex trong 1 phút, để
yên 5 phút. Đo quang phổ ở bước sóng 660 nm (OD660) dịch huyền phù trong ống
nghiệm có thêm p-xylen và dịch huyền phù trong ống nghiệm không thêm p-xylen. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn được tính thông qua chỉ số OD660 bằng
công thức tính hiệu suất đông tụ:
HS (%) = 100 0 0 OD OD OD m (Kimchhayarasy et al., 2009) (*)
- HS: Hiệu suất đông tụ (%)
- OD0: OD dịch huyền phù vi khuẩn không có p-xylen
- ODm: OD dịch huyền phù vi khuẩn có thêm p-xylen (dùng micropipette hút
phần dung dịchở phía đáy ống nghiệm)
3.4.3 Nhận diện, định danh vi khuẩn đông tụ bằng phương pháp sinh học phân tử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Mục tiêu: xây dựng được mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh được ít nhất 13 chủng vi
khuẩn đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL bằng phương
pháp sinh học phân tử.
b. Thực hiện: (i) Mỗi chủng vi khuẩn được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường Luria Bertani (LB) để thu sinh khối. DNA vi khuẩn được tách chiết theo
quy trình (Neumann et al.,1992), phản ứng PCR với cặp mồi (Zhao et al., 2010) có trình tự sau: 8F: 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’; 1492R: 5’ - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với
nồng độ 25 µl: H2O: 12,25 µl; Buffer + (NH4)2SO4:2 µl; MgCl2: 2 µl; dNTPs: 4 µl: 8F: 1 µl; 1492R: 1 µl: DMSO:0,5 µl: Taq-polymerase: 0,25 µl: DNA: 2 µl. Phản ứng PCR: 95oC/5’; 35 chu kỳ: (95oC/30”, 53oC/30”, 72oC/1,30”); 72oC/10; 10oC/’.
(ii) Sản phẩm PCR được tiến hành chạy điện di một chiều 90V máy Biorad SGE- 014-02 ( Mỹ) và chụp hình gel-Rad Universal Hood II (Mỹ). Chọn sản phẩm PCR
có band trên phổ điện di tương đồng mức 1.500 bp ở thang chuẩn plus 100. (iii) Sản
phẩm PCR được chọn, tiến hành tinh sạch bằng kit Invitrogen và gửi công ty
MACROGEN (Hàn quốc) giải trình tự DNA. (iv) Sử dụng chương trình BLAST N
để so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn cần so sánh với trình