Kết quả phân lập, nhận diện và tuyển chọn vi khuẩn đông tụ

L ời cam đoan

4.1Kết quả phân lập, nhận diện và tuyển chọn vi khuẩn đông tụ

4.1.1 Kết quả phân lập và nhận diện hình thái vi khuẩn đông tụ

Một trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn được phân lập từ 150 mẫu nước thải

trại chăn nuôi heo sau biogas, ở 52 huyện/thị tại 13 tỉnh/thành phố, khu vực đồng

bằng sông Cửu Long, thời gian thu mẫu vào buổi sáng trong ngày. Kết quả phân

tích các mẫu cho thấy, chỉ số pH trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở khu

vực ĐBSCL dao động từ 6,0 – 8,7. Mật độ vi khuẩn ở mỗi địa điểm thu mẫu trong tỉnh/thành cũng như ở các tỉnh/thành trong khu vực nghiên cứu có sự khác biệt

nhau (Bảng 4.1). Kết quả cho thấy, các chủng vi khuẩn phân lập có thể tồn tại trong môi trường nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở nhiều nơi trong khu

vực ĐBSCL, thích nghi được với nhiều điều kiện sống khác nhau, không phụ

thuộc vào môi trường nước mặn/lợ/ngọt hay cấu trúc, quy mô, thời gian tồn tại của

hầm biogas; số lượng, tuổi của heo và tồn tại ở mật độ cao (105 – 109 cfu/ml) trong cộng đồng vi khuẩn có trong môi trường mẫu nghiên cứu (Bảng 4.1).

Bảng 4.1: Vi khuẩn trong nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở ĐBSCL

STT Địa điểm thu mẫu (tỉnh/TP)

Tổng số

chủng/mẫu Ký hiệu pH

Mật số (tế bào/ml)

1 An Giang 9/11 AG01  AG09 6,5 – 8,3 105 – 107 2 Bạc Liêu 6/6 BL01  BL06 6,0 – 7,6 106 – 107 3 Bến Tre 11/14 BT01  BT11 6,1 – 7,8 106 – 108 4 Cà Mau 9/14 CM01  CM09 6,5 – 7,4 106 – 108 5 Cần Thơ 8/11 CT01  CT08 6,1 – 7,2 106 – 107 6 Đồng Tháp 7/7 DT01  DT07 6,2 – 7,1 106 – 107 7 Hậu Giang 10/11 HG01  HG10 6,8 – 8,0 106 – 108 8 Kiên Giang 16/21 KG01  KG16 6,5 – 8,7 106 – 109 9 Long An 6/6 LA01  LA06 6,4 – 7,1 106 – 106 10 Sóc Trăng 12/14 ST01  ST12 6,6 – 8,0 106 – 109 11 Tiền Giang 15/20 TG01  TG15 6,2 – 7,3 106 – 108 12 Trà Vinh 7/7 TV01  TV07 6,6 – 7,6 106 – 108 13 Vĩnh Long 8/8 VL01  VL08 6,0 – 8,5 106 – 109

Kết quả Bảng 4.1 cho thấy, mật độ vi khuẩn phân lập trong khu vực nghiên cứu dao động từ 105 – 109 tế bào/ml, pH dao động từ 6,0 – 8,5, phổ biến nhất ở

mức 6,5 – 8,0 tương đồng với kết quả của Lương Đức Phẩm, (2009) và có tính

tương quan thuận với nhau trong môi trường (Hình 4.1). y = 1,0078x - 0,0421 R2 = 0,9014 6 7 8 9 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

pH môi trường mẫu phân lập

M ậ t đ ộ v i k h u ẩ n ( L o g 1 0 c fu /m l)

Hình 4.1: Mối tương quan giữa pH với mật độ vi khuẩn trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas

Chủng vi khuẩn phân lập được tách thuần và bảo quản ở ống trữ riêng biệt,

tiến hành nhận dạng khuẩn lạc, kiểm tra hình thái vi khuẩn. Kết quả cho thấy, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường thạch polypepton phần lớn có màu trắng đục

(64,5%), một số ít khuẩn lạc có màu trắng trong (14,5%) hay trắng sữa (12,1%)

hoặc trắng vàng (8,9%). Khi khảo sát về hình dạng khuẩn lạc, có 84,7% khuẩn lạc

có dạng bìa không đều hoặc răng cưa, thậm chí chia thùy, một số ít khuẩn lạc

(15,3%) có bìa nguyên, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ cấy chuyền dao động từ

0,68 – 1,69 mm, độ nổi khuẩn lạc có hai dạng nhô hoặc lài, mặt ngoài khuẩn lạc

luôn ẩm ướt và có chất nhầy. Khi kiểm tra vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần (thị kính 10x vật kính 40) nhận thấy các chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng chuyển động, tuy nhiên có chủng chuyển động nhanh hoặc

chậm, tất cả đều có dạng hình que (ngắn hoặc dài). Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

cho thấy có 75,8% chủng vi khuẩn phân lập thuộc Gram dương, còn lại 24,2% là vi khuẩn Gram âm. (Hình 4.2b), (Bảng 4.2). Vi khuẩn Gram dương có thành peptidoglycan dày hơn vi khuẩn Gram âm, đây là một trong những đặc tính sinh

học đặc trưng của nhóm vi khuẩn Gram dương, giúp chúng thích nghi được với

nhiều điều kiện sống khác nhau trong môi trường, đồng thời chịu được điều kiện

trường chất thải đặc biệt là nước thải chăn nuôi heo sau biogas, vi khuẩn Gram

dương chiếm ưu thế hơn vi khuẩn Gram âm (Bảng 4.2). Thành peptidoglycan dày cũng là yếu tố giúp cho bề mặt tế bào vi khuẩn có được nhiều vùng kỵ nước hơn, đây là cơ sở cho quá trình tạo sự đông tụ của vi khuẩn hoạt động hiệu quả hơn

trong quá trình xử lý nước thải.

Hình 4.2: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập

(a) Khuẩn lạc chủng ST02, (b) Nhuộm Gram chủng VL01, (c) Chủng KG05 (d) Chủng VL05, (e) Chủng ST02 (f) Chủng VL01 [ảnh c, d, e, f chụp dưới KHV điện tử

quét (SEM), tại phòng thí nghiệm vi sinh vật chuyên sâu, trường Đại học Cần Thơ] Ngày chụp hình: 11/04/2013 c b a d f e

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái và hiệu suất hấp thụ với p-xylen của 32 chủng vi khuẩn phân lập trong nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas

S T T Chủng vi khuẩn phân lập Màu sắc, hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Kích thước khuẩn lạc (mm) Kết quả nhuộm Gram Hiệu suất hấp thụ với p-xylen (%±SD)

1 AG01 Trắng trong, bìa nguyên, lài, ít nhầy /, + 1,06 Âm 64±0,05 2 AG07 Trắng vàng, rìa cạn, lài, ít nhầy O, − 0,86 Dương 62±0,15 3 AG08 Trắng trong, bìa nguyên, mô, nhầy O, − 1,66 Dương 70±0,38 4 BL01 Trắng trong, bìa nguyên, lài, nhầy /, + 1,26 Dương 70±0,27 5 BL06 Trắng đục, rìa sâu, mô, nhầy /, − 0,93 Âm 59±0,38 6 BT02 Trắng trong, bìa nguyên, lài, ít nhầy O, − 0,90 Dương 70±0,11 7 BT05 Trắng vàng, rìa cạn, mô, nhầy /, + 1,16 Dương 71±0,59 8 CM01 Trắng đục, rìa cạn, mô, khô /, − 0,73 Dương 65±0,17 9 CM03 Trắng đục, rìa cạn, lài, ít nhầy O, − 0,86 Dương 71±0,10 10 CT02 Trắng trong, bìa nguyên, lài, nhầy /, + 0,33 Âm 71±0,38 11 CT03 Trắng sữa, rìa cạn, mô, khô /, + 1,10 Dương 66±0,66 12 DT06 Trắng trong, bìa nguyên, lài, ít nhầy O, + 0,36 Dương 65±0,17 13 DT07 Trắng sữa, bìa nguyên, khô, nhầy /, − 0,87 Âm 51±0,32 14 HG04 Trắng trong, rìa cạn, mô, nhầy O, + 1,10 Dương 71±0,40 15 HG09 Trắng vàng, rìa cạn, mô, ít nhầy /, + 1,06 Âm 65±0,56 16 HG10 Trắng vàng, rìa cạn, mô, ít nhầy /, − 1,23 Dương 73±0,21 17 KG03 Trắng trong, bìa nguyên, mô, khô /, − 1,33 Dương 65±0,12 18 KG05 Trắng đục, rìa cạn, mô, nhầy /, + 1,5 Dương 82±0,01 19 KG09 Trắng sữa, rìa cạn, mô, nhầy /, − 1,13 Âm 51±0,03 20 LA01 Trắng đục, rìa cạn, mô, khô /, + 1,06 Âm 53±0,02 21 LA04 Trắng đục, rìa cạn, mô, khô O, − 1,10 Dương 59±0,08 22 ST02 Trắng đục, rìa sâu, mô, nhầy /, + 1,10 Dương 77±0,03 23 ST04 Trắng trong, bìa nguyên, lài, ít nhầy /, + 0,4 Dương 69±0,05 24 ST07 Trắng trong, bìa nguyên, lài, khô /, + 1,03 Âm 70±0,02 25 TG02 Trắng trong, bìa nguyên, mô, ít nhầy O, − 0,96 Dương 71±0,06 26 TG03 Trắng sữa, rìa sâu, mô, nhầy /, + 1,06 Âm 55±0,17 27 TG09 Trắng vàng, rìa cạn, lài, ít nhầy O, − 1,10 Dương 72±0,01 28 TV03 Trắng trong, rìa cạn, lài, ít nhầy /, − 1,20 Dương 58±0,05 29 TV06 Trắng trong, rìa cạn, mô, ít nhầy /, + 1,16 Dương 70±0,05 30 VL01 Trắng đục, rìa cạn, mô, nhầy /, + 1,06 Dương 74±0,02 31 VL05 Trắng đục, rìa cạn, mô, nhầy /, + 1,13 Dương 73±0,01 32 VL08 Trắng trong, rìa cạn, lài, ít nhầy /, − 1,40 Dương 70±0,02

Theo Lương Đức Phẩm (2009), hầu hết các vi khuẩn tham gia vào quá trình làm sạch nước là nhóm vi khuẩn dị dưỡng, hoại sinh, hiếu khí và ưa ấm, đặc biệt

các phản ứng sinh hóa xảy ra ở các vi khuẩn là các phản ứng do enzyme xúc tác.

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật, nhiệt độ thích

hợp cho vi khuẩn thực hiện quá trình xử lý nước thải là từ 20 – 40oC, tối ưu là từ

25 – 30oC. Vi khuẩn phân lập ở ĐBSCL là vùng khí hậu nhiệt đới, đây là yếu tố

nhiệt độ thuận lợi cho vi khuẩn hoạt động tối ưu trong quá trình xử lý nước thải.

Kết quả minh họa Hình 4.2a cho thấy, trên môi trường thạch polypepton vi khuẩn

phân lập rất dễ nuôi cấy, ở nhiệt nhiệt độ 30oC trong 24 giờ, khuẩn lạc phát triển đều trên đường cấy trong môi trường phân lập theo quy trình phân lập vi khuẩn

hiếu khí. Kết quả này có thể khẳng định vi khuẩn phân lập thuộc nhóm hiếu khí và nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển tốt là 30oC. Ngoài ra, khi chụp ảnh vi

khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) độ phóng đại 6.500, 8.000, 10.000, 12.000 lần (Hình 4.2c, 4.2d, 4.2e, 4.2f) cho thấy, 4 chủng vi khuẩn này đều có

dạng hình que, tuy nhiên ở mỗi chủng khác nhau có kích thước không giống nhau. Bên ngoài tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứu còn được bao bọc bởi lớp bao nhầy (phần sáng bao quanh tế bào dưới kính hiển vi SEM). Lớp bao nhầy đã tạo

nên một lớp chất nhầy và luôn ẩm ướt trên bề mặt của khuẩn lạc. Trong số vi

khuẩn phân lập, khuẩn lạc có tính nhầy và ẩm ướt chiếm 81,25%, số còn lại bề mặt

khuẩn lạc tương đối khô và ít nhầy chiếm 18,75%, bao nhầy được cấu tạo từ các

polypeptide hoặc protein đóng vai trò dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn khỏi các điều kiện bất lợi (Trần Thị Thu Hiền, 2012). Ngoài ra, trên bao nhầy bao quanh tế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

bào của nhóm vi khuẩn này, còn có các vùng kỵ nước và các phân tử kỵ nước ở

lipid hoặc protein, đây là các thành phần quan trọng, góp phần khẳng định các phân tử kỵ nước có vai trò trong quá trình tạo sự đông tụ của nhóm vi khuẩn này.

Từ kết quả về đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hình thái và sinh lý của vi

khuẩn, cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập có nhiều đặc điểm tương đồng với

các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn Gram

dươngđược tìm thấy ở nhiều môi trường với nhiều chủng loài khác nhau và được ứng dụng nhiều trong cuộc sống, có tác động đáng kể đến hoạt động sống của con người trên nhiều lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công

nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, ydược học - chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, sản xuất chế phẩm sinh học, nhiên liệu sinh

học và nhiều sản phẩm khác được ứng dụng trong công nghệ sinh học như:

Bacillus thuringiensisđược sử dụng rộng rãi để tiêu diệt côn trùng có

hại, Bacillus subtilis sản xuất một loạt các peptide có hoạt tính sinh học cao

(Shalini et al., 2009). Theo nghiên cứu của Singh et al., (2013), Bacillus subtilis

NG220 được ứng dụng để xử lý nước thải ở nhà máy sản xuất đường có hiệu quả cao, đồng thời tạo ra poly β-hydroxybutyrate là thành phần tổng hợp nhựa phân

hủy sinh học. Bacillus aterrimus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus panis, Bacillus pumilis… giúp cải thiện môi trường.

4.1.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn đông tụ (tính kỵ nước của tế bào vi khuẩn)

Kết quả kiểm tra tính kỵ nước trên bề mặt tế bào vi khuẩn bằng cơ chế hấp

thụ của p-xylen với 124 vi khuẩn phân lập, đã chọn được 32 chủng vi khuẩn có

hiệu suất hấp thụ của dung môi p-xylen từ 50,1 – 81,8%, chiếm 25,8% trên tổng số

chủng vi khuẩn phân lập trong nước thải trại chăn nuôi heo sau biogas ở khu vực ĐBSCL (Bảng 4.2 và PL1).

Dung môi p-xylen là chất lỏng dạng este không tan trong nước (tính kỵ nước

cao). Trong môi trường lỏng, các vật chất có cùng tính chất có khuynh hướng hướng vào nhau (kết dính), đặc biệt là những vật chất có tính kỵ nước cùng tồn tại trong môi trường nước thì chúng sẽ kết cụm lại để che dấu phần kỵ nước. Kết quả

cho thấy, khi dung dịch huyền phù vi khuẩn được phối trộn với dung môi p-xylen (vortex), những thành phần có tính kỵ nước trong dung dịch sẽ gom tụ lại và có

khuynh hướng tách biệt phần phân tử nước ở môi trường. Trong đó những tế bào vi khuẩn có tính kỵ nước sẽ được p-xylen hấp thụ, gom tụ lại rồi tách ra khỏi nước,

nổi lên phía trên bề mặt của dung dịch (Hình 4.3). Như vậy, hiệu suất hấp thụ với

p-xylen càng cao là do tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn càng lớn, tạo cho

lực hút về p-xylen càng mạnh. Kết quả các tế bào vi khuẩn được gom tụ về hướng

p-xylen và tạo thành khối càng nhanh.

Hình 4.3: Dịch vi khuẩn chủng VL05, VL01, KG05 kiểm tra sinh hóa với p-xylen

* Ghi chú: (a) Dịch huyền phù vi khuẩn trước khi phối trộn với p-xylen (ĐC);

(b) Dịch huyền phù vi khuẩn sau khi phối trộn với p-xylen được lấy đo OD660 nm (c) P-xylen và tế bào vi khuẩnđược tách khỏi dịch huyền phù ban đầu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ngày chụp hình: 24/08/2012

Ba mươi hai chủng vi khuẩn có tính kỵ nước cao được xem là vi khuẩn có đặc tính đông tụ trong môi trường nước, nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào. Kết quả nghiên cứu tương đồng với kết quả nghiên cứu của Kimchachyarasy et al,.

(2009), khi nhóm tác giả này phân lập được chủng vi khuẩn Acinetobacter

ĐC VL05 ĐC VL01 ĐC KG05

(c) (b) (a)

johnsonii S35 từ bùn hoạt tính trong nước thải và tiến hành kiểm tra sinh hóa

chủng vi khuẩn này với dung môi p-xylen, kết quả cho hiệu suất đông tụ hơn 80%.

Theo Malik và Kakii, (2003), cũng cho rằng đặc tính sinh hóa của vi khuẩn đông

tụ là tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn và tùy theo chủng vi khuẩn có các

vùng kỵ nước ở bề mặt tế bào nhiều hay ít sẽ cho hiệu suất đông tụ cao hay thấp. Kết quả nghiên cứu còn tương đồng với kết quả của Malik et al., (2003) cho rằng,

chủng vi khuẩn Acinetobacter johnsonniứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải

có vai trò như cầu nối hợp tác với 2 chủng Oligotropha carboxidovorans, 3 chủng

Microbacterium esteraromaticum và Xanthomonas spp. Acinetobacter johnsonni

vì bề mặt tế bào của các chủng vi khuẩn này có tính kỵ nước cao (85% khi kiểm tra

sinh hóa với p-xylen), tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn được xem là yếu tố chính trong cơ chế đông tụ của vi khuẩn Acinetobacterjohnsonni với các chủng vi khuẩn khác trong môi trường. Vậy, cơ chế của quá trình đông tụ là sự kết dính

giữa các tế bào vi khuẩn với nhau nhờ vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào, qua đó

các vật chất lơ lửng trong môi trường được kết lại và lắng xuống cùng với khối vi

khuẩn. Tính kỵ nước của bề mặt tế bào càng cao thì hiệu suất đông tụ càng lớn, đây cũng là đặc tính sinh hóa của vi khuẩn đông tụ.

Để phân loại, định danh các chủng vi khuẩn phân lập được nhanh và chính xác, tiến hành thực hiện các kỹ thuật trong phương pháp sinh học phân tử và kết

hợp với kết quả kiểm tra sinh lý, sinh hóa, hình thái vi khuẩn. Từ đó làm cơ sởđể định danh được các chủng vi khuẩn đông tụ bản địa, góp phần ứng dụng vào xử lý nước thải chăn nuôi heo sau này.

4.1.3 Xây dựng mối tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh vi khuẩn đông tụ dựa trên trình tự 16S rRNA và định danh vi khuẩn đông tụ

Sản phẩm PCR được điện di trên agarose nồng độ 0,8%, kết quả chọn được

32 chủng phân lập đều có band tại vị trí 1.500 bp ở cặp mồi 8F và 1492R, khi so sánh với thang chuẩn DNA là 100 bp plus (Hình 4.4).

Hình 4.4: Phổ điện di sản phẩm PCR, 18 chủng vi khuẩn trên gel agarose 0,8%

Ghi chú: (0) thang chuẩn 100 bp plus, (1) TG09,(2) BL01,(3) CM03, (4) CT03, (5) HG10, (6) LA04,(7) ST02, (8) CM01, (9) VL01, (10) TV06, (11) VL05, (12) KG05, (13) AG07,(14) AG08,

(15) BT05, (ĐC) đối chứng âm, (16) DT07, (17) BT02, (18) TG02 - Chụp gel ngày: 31/01/2013

1.500 bp 

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ĐC 0 16 17 18

Trong số 32 sản phẩm PCR sau khi giải trình tự DNA, chọn được 18 trình tự