3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.5.4 Định lƣợng đƣờng khử
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớc sóng 490 nm. Kết hợp với phƣơng trình đƣờng chuẩn, suy ra hàm lƣợng Polysaccharide tinh khiết có chứa trong mỗi mẫu Polysaccharide tổng thô.
Thực nghiệm
Tiến hành thực hiện định lƣợng polysaccharide của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1 g) với các bƣớc thực hiện và tính tốn kết quả nhƣ trên.
3.3.5.3 Xác định đƣờng đơn trong mẫu linh chi
Đƣờng đơn có trong linh chi đƣợc xác định bằng cách lấy lƣợng đƣờng tổng trừ cho lƣợng polyssacharides đã xác định từ trƣớc.
3.3.5.4 Định lƣợng đƣờng khử Phƣơng pháp Phƣơng pháp
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 39
Chúng tôi lựa chọn thực hiện định lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp Bertrand đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.2.3a.
Tiến hành
Pha hóa chất
- Dung dịch Fehling A: pha dung dịch CuSO4.5H2O 4%.
- Dung dịch Fehling B: cân 200 g muối Seignette và 150 g NaOH, hòa tan trong nƣớc và chuyển vào bình định mức 1 lít rồi thêm nƣớc cất cho đến vạch mức, lắc đều.
- Dung dịch Fe3+ trong acid sulfuric (ở đây lựa chọn sắt (III) là FeCl3): hòa tan 40,625 g FeCl3 và 20 g H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) trong nƣớc cất và dẫn tới 1 lít.
- KMnO4 1/30 N: Cân 1,06 g KMnO4 hòa tan trong 1 lít nƣớc cất, đun nóng. Nồng độ đúng của KMnO4 đƣợc xác định bằng amoni oxalate hoặc acid oxalic ít nhất 1 ngày sau khi pha.
Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm
Do linh chi khơng chứa q nhiều tinh bột hay inulin, nên có thể chiết đƣờng từ linh chi bằng nƣớc. Cân và cho vào cốc 1 g nguyên liệu đã đƣợc nghiền nhỏ và sấy khô tới khối lƣợng không đổi. Nghiền cẩn thận với cát sạch và 30 mL nƣớc cất nóng ở 70 – 80 ºC. Chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 mL. Đun cách thủy 70 – 80 ºC trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì nitrate Pb(NO3)2 10%, tránh dùng quá dƣ. Sau đó, loại bỏ lƣợng chì nitrate dƣ bằng cách dùng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó, thêm nƣớc cất
đến vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khơ. Nƣớc lọc đƣợc dùng để làm thí nghiệm.
Thí nghiệm
- Lấy 10 mL dung dịch thí nghiệm cho vào bình nón dung tích 1000 mL.
- Thêm 10 mL dung dịch Fehling (5 mL dung dịch Fehling A và 5 mL dung dịch Fehling B).
- Đun sơi hỗn hợp 3 phút, tính từ khi bọt nƣớc đầu tiên xuất hiện. Sau khi đun sơi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trƣng. Nếu dung dịch bị mất màu hoàn toàn, chứng tỏ lƣợng dung dịch Fehling cho vào khơng đủ oxi hóa hồn tồn lƣợng
SVTH: Lê Trọng Quang
Nguyễn Thanh Tùng 40
đƣờng có trong dung dịch mẫu thí nghiệm. Trong trƣờng hợp đó, phải làm lại thí nghiệm với lƣợng dung dịch thí nghiệm ít hơn hoặc với lƣợng thuốc thử Fehling nhiều hơn.
- Để lắng kết tủa, lọc qua giấy lọc.
- Rửa bình và giấy lọc bằng nƣớc cất nóng 3 – 4 lần. Cần chú ý sao cho giữ phần lớn kết tủa Cu2O trên giấy lọc cũng nƣu trong bình nón ln đƣợc phủ bởi một lớp nƣớc nóng, tránh cho Cu2O khỏi bị oxi hóa bởi oxi khơng khí.
- Hịa tan kết tủa Cu2O bằng cách cho những lƣợng nhỏ 5 mL dung dịch sắt (III) trong môi trƣờng H2SO4 và dùng đũa thủy tinh khuấy cẩn thận để hịa tan hồn tồn lƣợng kết tủa Cu2O trên giấy lọc.
- Tráng cẩn thận bình và giấy lọc 3 – 4 lần bằng nƣớc cất nóng, cho vào bình nón 250 mL để chuẩn độ.
- Chuẩn độ dung dịch thu đƣợc bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền khoảng 20 – 30 giây.
- Từ lƣợng KMnO4 dùng chuẩn độ, tra bảng có thể suy ra đƣợc lƣợng đƣờng có trong mẫu thí nghiệm.
Tính kết quả
Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc tính theo cơng thức sau:
Trong đó: X – hàm lƣợng đƣờng (%).
a – số mg glucose tìm đƣợc khi tra bảng ứng với số mL KMnO4.
V – dung tích bình định mức (mL).
V1 – lƣợng dung dịch để xác định lƣợng đƣờng khử (mL). w – lƣợng mẫu thí nghiệm (g).
Thực nghiệm
Tiến hành thực hiện định lƣợng đƣờng khử của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1 g) với các bƣớc thực hiện và tính tốn kết quả nhƣ trên