- Cỏc sqc t# Cỏc phõn t S b e o v !
NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BIU HIN C A CHÚNG
5.2.1. Cỏc gen Cyt-P450c và Cyt-P450d (gia ỡnh P450 1)
S� t�ng h�p hai d�ng Cyt-P450, P4501A1 và 1A2 (P450c và P450d chu�t c�ng, P1-450 và P3-450 chu�t nh�t và nh�ng loài t�ơng t� v�i chỳng trong cỏc ��ng v�t khỏc) �ó ���c th�y là ���c kớch thớch t�ng h�p b�i vi�c thờm 3MC vào nh�ng
��ng v�t thớ nghi�m. M�c dự nhi�u h�p ch�t carbua thơm bao g�m m�t ch�t cú th� n�ng kớch thớch t�ng h�p nh� TCĐ, �ó
���c bi�t là ch�t c�m �ng ph� bi�n c�a hai lo�i gen trờn, �i�u rừ ràng là cơ ch� c�a s� �i�u hoà phiờn mó c�a hai gen Cyt- P450 là khỏc nhaụ Gen Cyt-P450c ���c bi�u hi�n trong nh�ng t� ch�c khỏc nhau nh� là gan, th�n, ph�i, da và nh�ng t� ch�c khỏc khi �ỏp �ng v�i nh�ng hoỏ ch�t cú kh� n�ng kớch thớch t�ng h�p, trong khi �ú Cyt-P450d ch� ���c bi�u hi�n h�n ch� �
gan. Nh�ng nghiờn c�u nuụi c�y ��u tiờn trờn t� bào gan, Cyt- P450d �ó b� m�t nhanh kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng, trong khi kh�n�ng này �Cyt-P450c v�n cũn l�i trong m�t th�i gian dàị
Nhi�u dũng t� bào nuụi c�y ���c l�y t� t� bào gan và nh�ng t� ch�c khỏc nh� là Hepa-1, H42E, MCF7 và t� bào Hela, Cyt-P450c �ó bi�u hi�n s� �ỏp �ng ��i v�i TCĐ ho�c 3MC thờm vào, trong khi �ú s� bi�u hi�n c�a Cyt-P450d h�u nh� r�t ớt ���c cụng b� cho b�t c� dũng t� bào nàọ So sỏnh trỡnh t� vựng upstream c�a promoter 2 gen Cyt-P450 này cho th�y r�ng chỳng d��ng nh� khụng cú �� nhi�u �i�m chung t�i m�c cú s� gi�ng nhau trong cơch� �i�u hoà phiờn mó.
Trỡnh t5 1i0u hũa hoEt1Fng - cis
K� thu�t gen phiờn mó ng��c, s� d�ng m�t h� th�ng bi�u hi�n phự h�p cho nh�ng dũng t� bào nuụi c�y và trỡnh t� gen cụ l�p �ó phỏc h�a trỡnh t� �i�u hũa trong vựng tr��c (upstream) c�a gen Cyt-P450c. Phõn �o�n rỡa DNA 5’ c�a gen Cyt-P450c
�ó h�p nh�t v�i gen reporter c�a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) và k�t qu� t�o thành gen kh�m �ó ���c chuy�n vào m�t dũng t� bào nuụi c�y, Hepa-1, kh� n�ng bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450c n�i sinh �ỏp �ng v�i vi�c ��a TCĐ ho�c 3MC thờm vàọ
Nguy�n Th�Ng�c Dao
136
Hỡnh 5.5. Nh�ng y�u t� �i�u hoà DNA phớa trư�c c�a gen Cyt-P450
M�i tờn ch� v� trớ c�a XRE và trỡnh t� ��ng nh�t c�a nú và chi�u h��ng c�a trỡnh t�. Nh�ng nucleotide cú d�u ch�m là bi�u hi�n nh�ng nucleotide ���c b�o v� kh�i s�methyl hoỏ do protein liờn k�t XRE b�ng y�u t� �ỏp�ng xenobiotic; BTE là y�u t�d�ch mó cơb�n.
Nh�ng t�bào Hepa-1 ���c chuy�n nhi�m v�i gen h�p nh�t nh�
trờn �ó���c th�y là bi�u hi�n ho�t tớnh CAT khi thờm cỏc ch�t kớch thớch t�ng h�p, v�i n�ng �� và tớnh ��c hi�u c�a cỏc ch�t c�m �ng là t�ơng t�v�i s�kớch thớch t�ng h�p c�a gen Cyt-P450c n�i sinh. Nh� v�y CAT bi�u hi�n t� gen h�p nh�t ���c chuy�n vào cú th� ���c xem nh� �ỏng k� ��i v�i kh� n�ng b�t ch��c s� bi�u hi�n t�ng h�p gen Cyt-P450c. Nh�ng s� m�t t� bờn ngoài ho�c bờn trong �ó���c��a vào vựng upstream c�a gen Cyt-P450c và nh�ng
��t bi�n thu ���c trong gen h�p nh�t�ó���c chuy�n nhi�m vào t�
bào Hepa-1. Vi�c xỏc ��nh ho�t tớnh CAT ���c t�o ra do t�ng h�p c�m �ng trong nh�ng t�bào chuy�n nhi�m�ó xỏc ��nh hai lo�i y�u t�cis-acting DNA �ỏp �ng cho s�bi�u hi�n c�m�ng c�a gen. M�t y�u t� ���c ký hi�u là XRE ho�c y�u t� �ỏp �ng v�i ch�t ngo�i lai, và ch�c n�ng c�a nú nh�là m�t ch�t t�ng c��ng s�t�ng h�p c�m
�ng. Trỡnh t�này ���c phõn b�5 l�n – 537, -1010, -1089, -1233 và -3586 bp �vựng tr��c c�a gen Cyt-P450c (hỡnh 5.5).
Y�u t� th� 2���c g�i là BTE ho�c y�u t� phiờn mó cơb�n và
Ch ng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s�bi�u hi�n c�a chỳng 137 phớa tr��c c�a trỡnh t� TATẠ Ít nh�t cú hai lo�i y�u t� cis-acting DNA là c�n thi�t cho m�c bi�u hi�n caọ Ng��i ta c�ng cụng b�v�
s� cú m�t c�a y�u t� DNA �i�u hoà khỏc nh� là m�t y�u t� cõm l�ng, tuy nhiờn nh�ng thu�c tớnh c�a nú thỡ ch�a���c bi�t rừ.
M�i �õy, ng��i ta �ó cụng b� r�ng cú nh�ng trỡnh t� t�ơng
��ng v�i GRE cú m�t trong intron ��u tiờn và nú ho�t ��ng nh� là nh�ng ch�t làm t�ng kh�n�ng c�m�ng t�ng h�p trong s� �ỏp �ng v�i hormon glucocorticoid. Khụng ph�i m�t b�n copy chớnh xỏc c�a trỡnh t�XRE, c�ng khụng ph�i m�t trỡnh t�c�a BTE cú m�t�vựng tr��c c�a gen P450. M�i�õy, m�t gen kh�m ���c t�o ra � trỡnh t�
vựng tr��c c�a gen P450d và gen c�u trỳc CAT �ó ���c phỏt hi�n là ���c bi�u hi�n cú tớnh c�m �ng trong nh�ng t� bào HepG2 khi cho 3 MC vàọ C�u trỳc c�a nh�ng ��t bi�n m�t �o�n trong gen kh�m và s� chuy�n nhi�m ti�p sau �ú c�a nú vào nh�ng t� bào HepG2 �ó xỏc ��nh 1 �o�n DNA ch�u trỏch nhi�m cho s�bi�u hi�n c�m�ng c�a gen. �o�n DNA này khụng ch�a 1 copy chớnh xỏc c�a XRE mà là m�t b�n d�ch cú bi�n ��i c�a XRẸ Tuy nhiờn, �o�n DNA này v�n ch�a���c xỏc ��nh là ��nh� ��rỳt ra k�t lu�n là li�u XRE b� bi�n ��i này cú ch�c n�ng th�c s� là ch�t làm t�ng kh�
n�ng t�ng h�p c�m �ng hay khụng. S� t�n t�i c�a XRE �ó ���c cụng b� trong nh�ng gen c�m �ng v�i 3 MC khỏc nh� là gen c�a glutathione-S-tranferasẹ
Trỡnh t�BTE (AGAAGGAGGCGTGGCC) �ó���c tỡm th�y là
ch�a trỡnh t� th�ng nh�t c�a h�p GC,
G/TG/AGGCGG/TG/AG/AC/T và ���c coi là m�t trỡnh t� chung b�i vỡ trỡnh t� BTE ho�c trỡnh t� t�ơng t� v�i nú xu�t hi�n trong vựng ngay g�n v�i trỡnh t�TATA c�a nhi�u cỏc gen khỏc, trong �ú ch� y�u ��u thu�c vào ��i gia �ỡnh gen Cyt-P450, gia �ỡnh này th�
hi�n nh�ng ki�u �i�u hũa gen khỏc nhau (hỡnh 5.6), chỳng cú kh�
n�ng ���c kớch thớch t�ng h�p ho�c b�i PB (P450b và c), ethanol, ho�c m�t y�u t� �nh h��ng n�i sinh c�a AMP vũng (P450scc và P450C21). M�t s� gen khỏc c�ng cú trỡnh t� t�ơng t� trong vựng promoter c�a chỳng. Tuy nhiờn, chỳng ta v�n cũn ph�i xem xột li�u cú hay khụng s�t�ơng t�v�trỡnh t�BTE trong nh�ng gen �ó tham gia th�c s�vào s� �i�u hoà phiờn mó.
Nh:ng yGu tA 1i0u hoà hoEt1Fng dEng trans
Núi chung, nh�ng y�u t� �i�u hoà ho�t ��ng d�ng trans ���c coi là liờn k�t v�i nh�ng y�u t� DNA ho�t ��ng d�ng cis theo cỏch
Nguy�n Th�Ng�c Dao
138
��c hi�u trỡnh t� �� �i�u hoà s� bi�u hi�n c�a gen. Nh�ng y�u t�
liờn k�t v�i trỡnh t�XRE �ó���c tỡm th�y trong ch�t chi�t t�nhõn t�bào Hepa-1 �ó���c x�lý v�i 3-MC ho�c TCĐ b�i th�nghi�m s� d�ch chuy�n trong gel, trong khi �ú nú khụng ���c tỡm th�y trong nhõn c�a nh�ng t� bào khụng ���c x�lý. Th� nghi�m ng�n c�n s� methyl hoỏ c�ng kh�ng ��nh r�ng 3 nucleotid trong trỡnh t�
XRE (nh�ng nucleotide cú ch�m trong hỡnh 5.5) �ó ���c b�o v�
kh�i s� methyl hoỏ b�ng cỏch liờn k�t v�i nh�ng y�u t� nhõn ph�
thu�c vào cỏch x�lý v�i TCĐ. Trong nh�ng t�bào x�lý v�i ch�t gõy c�m �ng, y�u t�liờn k�t XRE �ó���c tỡm th�y�m�t d�ng �n trong bào t�ơng (cytoplasm). Khi bào t�ơng ���c chu�n b� t�
nh�ng t�bào khụng x�lý, bào t�ơng khụng bi�u hi�n ho�t tớnh g�n XRE trong thớ nghi�m s�d�ch chuy�n trong gel.
Tuy nhiờn, d�a trờn vi�c�phõn �o�n bào t�ơng này v�i TCĐ ho�c 3 MC, ho�t tớnh liờn k�t XRE �ó ���c t�o rạ S� kớch thớch t�ng h�p này ph� thu�c vào n�ng �� c�a ch�t kớch thớch t�ng h�p và �� dài c�a th�i gian �.
Khi nh�ng t� bào Hepa-1 �ó ���c x� lý v�i cỏc ch�t c�m �ng, y�u t�liờn k�t XRE xu�t hi�n trong nhõn kốm theo s�gi�m c�a nú trong bào t�ơng, g�i ý v� s�chuy�n v� trớ nhõn c�a y�u t� liờn k�t kh�i bào t�ơng. Y�u t� liờn k�t XRE nhõn �ó ���c th�y là �i kốm v�i cỏc ch�t kớch thớch t�ng h�p. Nh�ng thu�c tớnh này c�a y�u t�
liờn k�t XRE g�i l�i v� Ah receptor, cỏi này �ó ���c nghiờn c�u trong th�i gian dài k� t� khi Poland cụng b� v� s� t�n t�i c�a nú trong bào t�ơng. M�i�õy, Gustavson và cs. sau khi tinh s�ch và ��c tr�ng tớnh ch�t, �ó g�i ý r�ng XRE (y�u t� liờn k�t) và Ah-receptor
�ó g�n k�t ch�t ch�v�i nhau ho�c r�ng chỳng là m�t ho�c cú cựng b�n ch�t. Ng��i ta c�ng cụng b� r�ng d�ng �n c�a y�u t� liờn k�t XRE �ó g�n v�i m�t protein shock nhi�t, HSP90, ��t�o ra m�t h�n h�p 9S trong bào t�ơng. Khi x�lý v�i ch�t c�m�ng, y�u t�liờn k�t
�ó b� tỏch kh�i HSP90 �� t�o ra m�t h�n h�p 6S và chuy�n v� trớ vào nhõn. T�t c�nh�ng thu�c tớnh này c�a y�u t�liờn k�t XRE ho�c Ah-receptor gi�ng th� nào �ú v�i thu�c tớnh c�a nh�ng steroid hormone receptor, nh�ng 1 s� trong cỏc y�u t� liờn k�t XRE �ó
���c th�y là liờn k�t v�i HSP90 trong nhõn. V�n cũn ph�i xem xột li�u s�phõn ly kh�i HSP90 cú ph�i là m�t�ũi h�i tuy�t��i cho s�
chuy�n v� trớ nhõn c�a y�u t�liờn k�t hay khụng. Ng��c l�i v�i y�u t� liờn k�t XRE, y�u t� liờn k�t BTE ���c ��nh v� khụng thay ��i trong nhõn c�a khụng ch� cỏc t�bào gan mà cũn �c�nh�ng t� bào
Ch ng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s�bi�u hi�n c�a chỳng 139 nuụi c�y ho�c nh�ng t� bào c�a cỏc t� ch�c khỏc, nh�ng t� ch�c này khụng bi�u hi�n Cyt-P450c ho�c d, g�i ý r�ng y�u t� liờn k�t BTE là m�t y�u t� �i�u hoà chung ho�t ��ng khụng ch� riờng gen Cyt-P450.
S� dũng hoỏ cDNA m�i �õy c�a nh�ng protein này �ó thành cụng. Ki�u��c�i�m c�u trỳc ngún tay k�m (zinc-finger) ���c nh�c l�i 3 l�n trong protein liờn k�t BTẸ Cơch�chi ti�t c�a protein liờn k�t BTE trong �i�u hoà s�phiờn mó c�a gen Cyt-P450c và s� ��ng tỏc d�ng c�a nú v�i y�u t�liờn k�t XRE �ang ���c nghiờn c�ụ