- Cỏc sqc t# Cỏc phõn t S b e o v !
NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BIU HIN C A CHÚNG
5.4.5. Cyt-P45011 (CYP11B1 và CYP11B2)
M�t cDNA cho Cyt-P45011 �ó���c tỏch ra t�th�vi�n th�n bũ và trỡnh t� nucleotid c�a nú �ó ���c xỏc ��nh. cDNA này mó hoỏ cho m�t ti�n ch�t polypeptid c�a Cyt-P45011 ch�a 503 axit amin. Ti�n ch�t polypeptid này ���c chuy�n vào ti th� và protein ��y�� ���c t�o ra, protein này ch�a 479 acid amin, ���c g�n � màng trong c�a ti th�. Trong 1 nghiờn c�u ti�p theo, cDNA khỏc �ó ���c xỏc ��nh trong th�vi�n bũ. S�khỏc nhau gi�a 2 cDNA là chỳng �ó cú s� thay th� nucleotid � v� trớ th� 14 d�n t�i s� thay th� 3 acid amin. Phõn tớch Northern blot s� d�ng 2 oligonucleotid khỏc làm ch�t th� ��c hi�u cho 2 cDNA này ��u ch�ra r�ng ớt nh�t cú 2 lo�i Cyt-P45011 mRNA �ó���c bi�u hi�n trong nh�ng cỏ th� ��ng v�t khỏc nhaụ
Nguy�n Th�Ng�c Dao
160
Nh�ng t� bào COS-7 �ó ���c chuy�n nhi�m v�i nh�ng vector bi�u hi�n ch�a t�ng cDNAs P45011 riờng r� c�a bũ. Nh�ng phõn tớch v�mi�n d�ch blot c�ng nh�quan sỏt hi�n vi mi�n d�ch �i�n t�
nh�ng t�bào COS-7 �ó ch�ra r�ng nh�ng protein phỏt tri�n��y��
(chớn) c�a Cyt-P45011 �ó ���c bi�u hi�n trong ti th�. Khi ti th� ���c bi�u hi�n�ó ���c ki�m tra ho�t tớnh th�y phõn v�i s�cú m�t c�a adrenodoxin và adrenodoxin reductase, thỡ s�chuy�n hoỏ t�11- deoxycorticosterone thành corticosterone (thu�phõn v� trớ 11 ),18- OH-11-deoxycorticosterone (thu� phõn v� trớ 18) và 19-OH-11- deoxycorticosterone (thu� phõn v� trớ 19), và chuy�n t�
corticosterone thành 18-hydroxycortecosterone và aldosterone (methyl hoỏ v� trớ 18) �ó x�y rạ Nh�ng k�t qu� này th� hi�n m�t cỏch rừ ràng r�ng P45011 bũ xỳc tỏc t�t c� cỏc b��c th�y phõn t�
11-deoxycorticosterone thành aldosteronẹ
M�t cDNA mó hoỏ cho Cyt-P45011 chu�t �ó ���c tỏch t�th�
vi�n th�n ���c l�y t� nh�ng ��ng v�t ���c x� lý b�ng ACTH. Nh�ng t� bào COS-7 ���c chuy�n nhi�m v�i plasmid bi�u hi�n ch�a cDNA chuy�n hoỏ trung gian nh�ng ph�n�ng th�y phõn v�trớ 11 - và 18 c�a 11-deoxycorticosterone, nh�ng m�t kh� n�ng t�o ra aldosteronẹ Trờn cơs� gi�thi�t r�ng enzyme aldosterone synthase
� chu�t là 1 protein cú liờn quan ch�t nh�ng khỏc v�i 11 - hydroxylase, 1 thớ nghi�m �ó ���c ti�n hành trong �ú th� vi�n cDNA c�a vựng glomerulose th��ng th�n thu ���c t� nh�ng con chu�t �ó b� làm gi�m Na+ �ó ���c sàng l�c, Cyt-P45011 cDNA chu�t ���c s� d�ng nh�là 1 ch�t th�. Hai cDNA �ó���c tỏch ra, trỡnh t� c�a nú t�ơng ��ng cao v�i nhau và t�ơng ��ng (kho�ng 80%) v�i trỡnh t� c�a P45011 cDNẠ Nh�ng k�t qu� bi�u hi�n cDNA trong nh�ng t� bào COS-7 �ó ch� ra r�ng m�t trong nh�ng cDNA thu ���c là gen c�a aldosterone synthase (chu�t). Nh�ng k�t qu�này xỏc ��nh r�ng v�th��ng th�n chu�t cú ớt nh�t 2 d�ng khỏc nhau c�a Cyt-P45011 , m�t là 11 -hydroxylase và cỏi khỏc là aldosterone synthasẹ
Hai gen Cyt-P45011 ng��i (CYP11B1 và CYP11B2) �ó ���c tỏch ra, CYP11B1 �ó ���c s�p x�p trờn NST 8q. M�i cỏi trong 2 gen này ch�a 9 exon và 8 introns. Trỡnh t�nucleotid c�a CYP11B1 và 11B2 là 95% trựng nhau và kho�ng 90% trựng nhau trong cỏc introns. M�c dự khụng cú nh�ng ��t bi�n m�t �o�n nào ���c nh�n th�y trong trỡnh t�mó húa c�a 11B2, s�phiờn mó c�a nú�ó khụng
Ch ng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s�bi�u hi�n c�a chỳng 161 ���c phỏt hi�n trong mRNA c�a th�n ng��ị C�11B1 và 11B2 ��u ch�a m�t trỡnh t�TATA gi� ��nh�-42bp, và m�t CRE gi� ��nh�- 78bp. Vựng khỏc ���c quan tõm là �nh�ng v�trớ gi�a -244bp và - 192bp trong 11B2 và gi�a -331bp và -278bp trong 11B2. Trỡnh t� c�a nú gi�ng m�t trỡnh t�gi�a -241bp và -200bp trong gen P450C21, trỡnh t�này ���c ngh�là ho�t��ng ch�c n�ng nh� là m�t ch�t làm t�ng��c hi�u t�ch�c. B�n dũng khỏc c�a gen P45011 bũ �ó���c tỏch, 2 trong s� �ú là gi�gen. Gen P45011 bũ dài kho�ng 8,5kb và chia vào 9 exon và 8 introns. M�t trỡnh t� gi� ��nh c�a h�p TATA ��nh v� � -29bp, 1 trỡnh t� CRE gi� ��nh, � -71bp, và m�t y�u t� liờn k�t AP-2 gi� ��nh, � -257bp. Khụng cú trỡnh t� nào t�ơng t� h�p CAAT ���c xỏc ��nh.
Vựng rỡa 5’ c�a gen P45011 chu�t �ó ���c nghiờn c�u v�i hy v�ng cú th� suy �oỏn ���c cơ ch� �i�u hũa c�a s� bi�u hi�n gen. Trong vựng rỡa 5’ c�a gen chu�t, 1 d�ng bi�n��i c�a h�p TATA �ó
���c ��nh v� � -29bp, và trỡnh t� t�ơng t� v�i trỡnh t� ���c cụng nh�n��i v�i h�p CAAT �ó cú m�t�-93bp và -213bp. M�t CRE th�
n�ng �ó ��nh v� � -56bp, và 2 b�n sao c�a 1 y�u t� t�ơng t� gi�a - 215bp và -200bp trong gen P450C21 chu�t, cỏi này �ó ���c ngh� là c�n thi�t cho s�bi�u hi�n c�a 21-hydroxylase, �ó cú m�t �-249bp và -148bp.
Trỡnh t� rỡa 5’c�a gen chu�t ���c ��t phớa tr��c c�a gen hGH reporter và ���c chuy�n nhi�m vào nh�ng t� bàoY-1 ho�c t� bào MA-10 (t� bào Leydig c�a chu�t nh�t). M�c �� bi�u hi�n c�a p- 1500GH, 1 plasmid ch�a 1500bp c�a trỡnh t�rỡa 5’ t� gen P45011
chu�t nh�t ���c khu�ch tỏn vào gen reporter c�a hGH, vào t� bào MA-10 ớt nh�t 20 l�n th�p hơn là m�c bi�u hi�n c�a p-1500GH trong nh�ng t� bào Y-1, xỏc ��nh r�ng 1 y�u t� �ũi h�i cho bi�u hi�n ��c hi�u t� ch�c (th�n) c�a chu�i gen P45011 trong vựng 1500bp upstream tớnh t�v�trớ b�t��u phiờn mó.
í�� ti�p theo nh�m xỏc ��nh trỡnh t�trong vựng prometer c�a gen P45011 , là vựng quan tr�ng ��i v�i s� �i�u hũa phiờn mó, �ó
���c ti�n hành b�ng cỏch phõn tớch s�m�t��u 5’. Nh�ng t�bào Y- 1 ���c chuy�n nhi�m v�i nh�ng plasmid ch�a nh�ng �o�n cú ��
dài khỏc nhau c�a trỡnh t�rỡa 5’ �phớa tr��c gen hGH. p-1500GH và p-425GH �ó tr�c ti�p t�ng h�p�m�c cú kh�n�ng so sỏnh ���c (comparable) c�a hGH, kh�ng��nh s�thi�u h�t c�a 1�o�n c�n thi�t
Nguy�n Th�Ng�c Dao
162
gi�a -1500bp và -425bp. Cú s� gi�m 2,5 l�n trong bi�u hi�n hGH (t� 100% ��n 40%) x�y ra do b� m�t ��n -338bp, g�i ý r�ng m�t trỡnh t� gi�a v� trớ -425 và -338 �ó tham gia vào s� bi�u hi�n gen P45011 .
M�t s� gi�m ti�p t�c 2 l�n n�a trong bi�u hi�n gen hGH (t�
40% ��n 20%) �ó x�y ra khi trỡnh t�b�m�t t�i -123bp. M�t�v�trớ -40bp làm m�t hoàn toàn s� bi�u hi�n. K�t qu� này g�i ý r�ng nh�ng y�u t� cú trỡnh t� �a d�ng trong promoter c�a P45011 là c�n thi�t cho s�bi�u hi�n t�i�ạ
S� quan tr�ng c�a trỡnh t� CRE � v� trớ -56bp trong bi�u hi�n c�a gen P45011 �ó���c quan sỏt th�y khi s� d�ng 1 plasmid ch�a 1 trỡnh t� �ó bi�n��i c�a CRẸ Nh�ng t�bào Y-1 �ó���c chuy�n nhi�m v�i p-1500 CREGH, 1 plasmid ���c nh�n t� P-1500GH trong �ú trỡnh t� gi�a -56bp và -40bp (5’-TGACGTGA -3’) �ó b�
bi�n��i do ��t bi�n ch�n l�c v� trớ thành 5’-GTCATGTC-3’). S�
bi�u hi�n gen hGH �ó b�gi�m�i ớt nh�t 50 l�n trong plasmid mang
��t bi�n�-56bp.
M�t protein kinase ph� thu�c cAMP ch�c n�ng ���c �ũi h�i m�t cỏch tuy�t��i cho s�bi�u hi�n c�a gen P45011 �ó���c ch�ng minh b�ng cỏch s�d�ng 1 dũng t� bào ��t bi�n Y-1. Nh�ng t�bào
�ú m�t protein kinase và nh�ng t� bào lo�i Y-1 d�i �ó b� chuy�n nhi�m v�i p-1500GH và cỏc m�c bi�u hi�n c�a gen hGH �ó ���c xỏc ��nh. M�c �� bi�u hi�n trong nh�ng t� bào ��t bi�n �ó gi�m
�ỏng k�so v�i trong t�bào type d�ị
�nh h��ng c�a cAMP thờm t� ngoài vào lờn s� bi�u hi�n gen P45011 �ó���c nghiờn c�u trờn cỏc t�bào Y-1 ���c chuy�n nhi�m v�i nh�ng plasmid ch�a cỏc �o�n cú �� dài khỏc nhau c�a trỡnh t�
rỡa 5’. Vi�c x�lý nh�ng t�bào b�chuy�n nhi�m p-1500GH b�ng 8- Br-cAMP làm t�ng bi�u hi�n c�a gen reporter lờn 3-8 l�n. B�ng nh�ng phõn tớch m�t��u 5’, 123 bp c�a trỡnh t�rỡa 5’ �ó ���c th�y là �nh h��ng ��n s�t�o thành cAMP, trong khi �ú, x�lý cAMP �ó th�t b�i��i v�i s�bi�u hi�n hi�u qu�c�a 1 plasmid ch�cú 40bp c�a vựng rỡa 5’. Cú th�th�y rừ r�ng 1 trỡnh t�t�ơng t�CRE �ó cú m�t trong vựng gi�a -56bp và -49bp, nh�ng k�t qu�này cú liờn quan v�i gi� thi�t r�ng �ỏp �ng v�i cAMP c�a bi�u hi�n gen P45011 �ó ��t
���c b�i s� ho�t ��ng c�a 1 y�u t� cis- acting trong vựng nàỵ Theo quy lu�t, �� xỏc ��nh n�u trỡnh t� � -56bp th�c s� cú ch�c n�ng nh�là 1 CRE, thỡ trỡnh t�CRE gi� ��nh�ó���c dũng hoỏ vào
Ch ng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s�bi�u hi�n c�a chỳng 163 vựng tr��c gen c�a m�t trỡnh t� promoter c�a thymidine kinase, ho�c m�t vựng promoter c�a 1 d��i �ơn v� c�a choriomic gonadotropin, ngay phớa tr��c gen reporter CAT c�a vi khu�n. Nh�ng t�bào Y-1 �ó���c chuy�n nhi�m v�i nh�ng c�u trỳc và s�
bi�u hi�n CAT trong nh�ng t� bào Y-1 �ó ���c xỏc ��nh trong s�
cú m�t, ho�c v�ng m�t c�a 8-Br-cAMP. Vi�c thờm vào trỡnh t�
CRE �ó khụng�nh h��ng ��n s�bi�u hi�n cơb�n (basal) c�a CAT
���c�i�u ph�i b�i promoter khỏc, nh�ng d�n t�i 1 s�l�n t�ng trong bi�u hi�n sau khi x� lý v�i 8-Br-cAMP. Nh�ng k�t qu� này xỏc
��nh r�ng trỡnh t�gi�ng CRE �-56 bp t�o kh� n�ng t�ng h�p c�m
�ng cAMP ��i v�i promoter t� nh�ng gen d��i �ơn v� � c�a thymidin kinase và choriomic gonaldotropin. Nh�ng phõn tớch Southern bloting ch�ng t� r�ng 1 protein nhõn cú TLPT 43.000 trong d�ch ��ng th� c�a nh�ng t� bào Y-1, Hela ho�c PC-12 (pheochromocytoma) liờn k�t vào 1 m�u th�cú trỡnh t�gi�ng CRE trong promoter c�a P45011 .
G�n �õy, t�nh�ng phõn tớch chi ti�t cỏc y�u t� �i�u hoà cAMP trong vựng promoter c�a gen P450 11�, ng��i ta �ó cụng b� là �ó xỏc ��nh ���c ớt nh�t 2 y�u t� khụng cú trỡnh t�t�ơng t� v�i trỡnh t�CRE �ó���c ch�p nh�n.
Cỏc nghiờn c�u v� �nh h��ng c�a cỏc g�c axit amin �m�t s�v�
trớ ���c cho là cú vai trũ quan tr�ng ch�c n�ng � CYP 11B1 và 11B2, nh� là cỏc v� trớ isoleucine 112, axit aspartic 147 và lysine 152 c�a CYP 11B2 ng��i�ó���c ti�n hành b�ng cỏch t�o ra cỏc v�
trớ thay th� axit amin nh� I112S, I112P, D147E, I112P/D147E, D147E/K152N và I112P/D147E/K152N. Trong nh�ng nghiờn c�u bi�u hi�n, cỏc s�n ph�m khỏc nhau �ó ���c quan sỏt �ỏnh giỏ ��
th�y���c vai trũ c�a cỏc axit amin �nh�ng v�trớ nghiờn c�ụ
�tuy�n th��ng th�n ng��i, CYP11B1 xỳc tỏc s� th�y phõn v�
trớ 11� c�a 11-deoxycortisol �� t�o ra cortisol (trong vựng zona fasciculate/reticularis), nơi mà 3 b��c k�t thỳc trong s�chuy�n húa sinh h�c c�a aldosterone ���c ti�n hành b�i CYP11B2 x�y ra trong
zona glomerulosa. Trong l��i ty th�, chỳng ho�t ��ng trong l�p
��m v�i s�cú m�t c�a AdR và Adx. S�khỏc nhau �v�trớ 29 trong c�u trỳc d�ng t�nhiờn c�a chỳng �� l�n�� xỏc ��nh s�khỏc nhau v� ��c hi�u khụng gian và ��c hi�u vựng c�a ho�t tớnh xỳc tỏc. Cú 3
�i�m sai khỏc trong c�u trỳc b�c m�t c�a CYP 11B1 và CYP11B2
Nguy�n Th�Ng�c Dao
164
v�i s� ��c hi�u xỳc tỏc c�a CYP11B2 �ó ���c nghiờn c�u b�ng cỏch thay ��i I112, D147 và N152 thành serine và prolin, glutamate và asparagines, m�t cỏch t�ơng �ng. B�ng cỏch �ú ng��i ta c�ng bi�n ��i thay th� cỏc axit amin t�ơng �ng c�a 11� hydroxylase ng��i, chu�t nh�t và chu�t c�ng, m�t cỏch t�ơng �ng. K�t qu� ch�
ra r�ng: Nh�ng bi�n��i I112S và K152N khụng �nh h��ng�ỏng k�
t�i ho�t tớnh enzyme c�a CYP11B2. Ng��c l�i, I112P, D147E và I112 P/D147E làm t�ng rừ r�t ho�t tớnh enzymẹ Th� n�ng th�y phõn v�trớ 11� �ó t�ng m�nh� ��t bi�n D147E (4 l�n) hơn là � ��t bi�n I112P (3 l�n) so v�i ho�t tớnh c�a type d�ị Khi k�t h�p c� 2
��t bi�n này l�i thỡ ho�t tớnh c�a b��c xỳc tỏc ��u tiờn l�i t�ng cao hơn n�a (6 l�n). ��i v�i s�th�y phõn v�trớ 18 tr��c h�t�ó t�ng lờn 1,5 l�n� ��t bi�n I112P, trong khi �ú D147E �ó khụng�nh h��ng gỡ t�i cỏc b��c xỳc tỏc. V�i I112S, isoleucine 112 �ó khụng t�ơng tỏc tr�c ti�p v�i cơ ch�t nh�ng nú v�n là c�n thi�t cho ho�t tớnh riờng (��c bi�t là v�i s�th�y phõn v�trớ 18) c�a CYP11B2 (I112P). Hơn n�a, gi�ng nh� I112, D147 �úng vai trũ quan tr�ng và thi�t y�u trong s�xỏc ��nh c��ng��và s� ��c hi�u ch�c n�ng, tr��c h�t là c�a s� th�y phõn v� trớ 11�,��c bi�t �ỏng chỳ ý là s� liờn quan c�a nú và c�a ph�n acid amin t�n cựng ��i v�i ho�t tớnh xỳc tỏc c�a enzymẹ (Stephanie Bechtel, Mathias Hampf and Rita Bernhardt., 2000).
5.4.6. P450arom
cDNA cho Cyt-P450arom �ó ���c tỏch t� th� vi�n cDNA c�a nhau thai ng��i và bu�ng tr�ng gà. Nh�ng nghiờn c�u bi�u hi�n gen ���c ti�n hành trờn nh�ng t�bào COS-1 �ó���c chuy�n nhi�m b�i cDNA P450arom gà con, �ó ���c xỏc ��nh 1 cỏch khụng nghi ng�r�ng 1 polypeptid chu�i�ơn cú th�xỳc tỏc toàn b�trỡnh t�c�a nh�ng b��c tham gia vào ph�n�ng t�ng quỏt c�a aromatasẹ
Gen ng��i mó hoỏ cDNA P450arom (CYP19) �ó���c ghi nh�n�
NST 15. Cỏc �o�n gen dài ớt nh�t 52 kb và ���c c�u t�o t�10 exon, exon ��u tiờn c�a chỳng khụng ���c d�ch mó. M�t trỡnh t� TATA gi� ��nh�ó���c��nh v� �-23bp và h�p CAAT gi� ��nh�ó cú m�t
�-41, -67 và -83bp. M�t trỡnh t�CRE gi� ��nh�- 211bp, và 1 trỡnh t� �i�u hũa cis liờn k�t AP-1 gi� ��nh s� cung c�p s� �ỏp �ng protein kinase C t�i -54bp. Nh�ng y�u t� �ỏp �ng cho s�
esterphorbol cú th� � -604bp và -1094bp. Nh�ng y�u t� �i�u hũa glucocorticoid �ó���c tỡm th�y�-352bp và trong intron ��u tiờn �
Ch ng V. Nh�ng gen Cyt-P450 và s�bi�u hi�n c�a chỳng 165 +346bp. Khụng cú k�t qu� nào g�i ý v� s� cú nhi�u hơn 1 gen P450arom trong genom ng��ị