- Cỏc sqc t# Cỏc phõn t S b e o v !
P hn & ng ' #c th( nghi)m Cch tp hn & ng
CA4H t,n m t,n m men Cinnamate 4-Hydroxylase O OH ++++ 7-Ethoxycoumarin O-Deethylase O O O H5C2 ++ 7-Methoxycoumarin O- Demethylase CH3O- + p-Chloro-N-methylaniline (PCMA) Cl N CH3 H ++ Chlorotoluron hydroxylase C H3 NH Cl O N C H3 CH3 +
Hi�n nay, cú r�t ớt thụng tin v�m�i liờn quan gi�a cỏc Cyt-P450 th�c v�t cựng tham gia trong cựng m�t con �ư�ng chuy�n hoỏ, nguyờn nhõn cú th�là, m�c dự vi�c phõn tớch trỡnh t�cDNA �ó tr�
nờn cú th�, nhưng v�n r�t ớt (cho t�i gi�m�i cú 3) �ó �ư�c g�n v�i m�t ph�n �ng sinh lý. Trong hỡnh 4.7: di�n t� s� gi�ng nhau gi�a CA4H tỏch t� Artiso Jerusalem và 3 trỡnh t� CYP73 khỏc t� lo�i cõy cú t�n, cõy ��u xanh và Ạthalianạ V� trớ axit amin ��ng nh�t >80% là r�t cao khi xột ��n kho�ng cỏch ti�n hoỏ gi�a ph�c h�p
fabaceae và brassicaceaẹ�i�u này là b�ng ch�ng cho vai trũ trung tõm c�a CA4H, ch�t xỳc tỏc bư�c oxy hoỏ ��u tiờn trong con �ư�ng
Nguy�n Th�Ng�c Dao 112
chuy�n hoỏ phenylpropanoid. Dũng cu�i cựng trong hỡnh 4.7 cho th�y s�gi�ng nhau gi�a cinnamate hydroxylase và 2 flavonoid 3’5’- hydroxylases (CYP 75), enzyme này oxy hoỏ nh�ng flavonoids ki�u cinnamatẹ Tuy nhiờn, ch� m�t ớt g�c c�m l�i�m�t s� v�trớ là �ư�c b�o t�n gi�a 2 gia �ỡnh. C�ng r�t hay là v�i c�u trỳc tinh th� m�i�õy c�a Cyt-P450BM 3 và Cyt-P450 scc, cú th� xỏc ��nh�ư�c cỏi gỡ quy�t��nh trong s�nh�n d�ng cơch�t.
Hỡnh 4.7. Hàng trờn cựng (CYP73.Con) th�hi�n s�tương ��ng gi�a cỏc CYP73 c�a 4 loài th�c v�t: Artiso Jerusalem, Ạ thaliana, cõy ��u xanh và cõy d�ng t�n, hàng dư�i (pheprop. Con) th�hi�n s�tương ��ng gi�a
cỏc CYP73 và CYP75
Hỡnh 4.8 bi�u di�n m�i liờn quan ki�u t�ng�ụi m�t trong s�26 Cyt- P450 th�c v�t. Ch� cú 4 CYP73 (cinnamate hydroxylase) và flavonoid 3’5’-hydroxylase mó húa cho m�t ch�c n�ng sinh lý xỏc ��nh. 16C rừ r�ng là m�t thành viờn m�i c�a gia �ỡnh CYP73. �ỏng chỳ ý là khụng cú m�t cỏ th� nào c�a cỏc Cyt-P450 này là tương t� v�i m�t Cyt-P450 nào khỏc � ��ng v�t ho�c vi sinh v�t. Trỡnh t� t� 1C t�i 16C �ó thu �ư�c t� Catharantus roseus b�ng ph�n �ng PCR s� d�ng m�t m�i suy di�n vựng liờn k�t hem (Meijer và cs., 1993). Vỡ trỡnh t� t� 1C ��n 16C là r�t riờng bi�t (t� Cys liờn k�t hem t�i ��u carboxy t�n), nờn cõy ph� h� �ư�c d�a trờn m�t trỡnh t�r�t cỏ bi�t.
Ch ng IV. H�th�ng Cytochrome-P450 �vi sinh v�t và th�c v�t 113
Hỡnh 4.8. Cõy ph�h�c�a Oc: CYP72, 1c ��n 16c:16 CYP450 khụng
��ng nh�t t�C. roseus .1,2,3 4: CYP 73 t�4 loài; 5: flavonoid 3’ 5’ hydroxylase; 6: CYP 71; 7,8,9: nh�ng Cyt-P450 khụng xỏc ��nh
Theo D. Nelson (http://dnelson.ulmen.edu/cytochrome P450.html), ��n nay ngư�i ta �ó ghi nh�n�ư�c ớt nh�t 249 gen CYP ho�t ��ng � cõy mự t�c Arabidopsis thaliana chi�m kho�ng 1% genome c�a nú.
Arabidopsis Cyt-P450 xỳc tỏc bư�c ��u tiờn c�a s� sinh t�ng h�p Indol-3-acetic acid ph� thu�c tryptophan (Annak et al.2000). Th�c v�t t�ng h�p m�t lư�ng l�n cỏc ch�t chuy�n húa th� c�p t� cỏc axit amin và nucleotidẹ Nhi�u ch�t trong s� �ú cú vai trũ quan tr�ng trong s�phỏt tri�n c�a th�c v�t và nhưlà nh�ng ch�t�� khỏng ch�ng l�i cỏc y�u t�gõy b�nh. Ch�t chuy�n húa th�c�p là d�n xu�t c�a tryptophane bao g�m carnalexin, indole glucosinolates và indole -3-acetic acid (IAA). Tuy nhiờn nh�ng bư�c�� t�ng h�p ra chỳng �i t� tryptophan ho�c nh�ng ti�n ch�t c�a nú v�n cũn chưa rừ. Ngư�i ta �ó xỏc ��nh �ư�c 2 lo�i Arabidopsis Cyt-P450 (CYP 79B2 và CYP 79B3) cú th�chuy�n húa tryptophan thành indole-3- acetaldoxine (IAO x), m�t ti�n ch�t c�a IAA và indole glucosinolates.
Arabidopsis CYP 85A2 là m�t Cyt-P-450 tham gia chuy�n húa trong s� oxy húa Baeyer-Villiger c�a Castasterone thành Brassinolide trong quỏ trỡnh sinh t�ng h�p Brassinosteroid (Tae- Wuk Kim et al.2005).S� chuy�n húa t� castasteron(CS) sang brassinolide(BL), s� oxy húa ki�u Baeyer-Villiger, là bư�c cu�i
Nguy�n Th�Ng�c Dao 114
cựng và là bư�c h�n ch� t�c �� trong s� sinh t�ng h�p BL � cõy xanh. Cyt-P450 85A2 c�a Arabidopsis thaliana �ư�c bi�u hi�n d� th�trong n�m men �ó chuy�n húa CS thành BL c�ng nhưlà s�oxy húa v�trớ C6 c�a brassinosteroids (BRs). �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450 85A2 là m�t enzyme hai ch�c n�ng v�a oxy húa BR C6 v�a ho�t��ng nhưBL synthasẹ Nh�ng nghiờn c�u v�sinh lý, húa sinh và di truy�n phõn t�c�a nh�ng dũng bi�u hi�n m�t ch�c n�ng ho�c bi�u hi�n quỏ m�c Arabidopsis CYP 85A2 �ó ch�ng minh r�ng castasteron ph�i là m�t brassinosteroid ho�t ��ng sinh h�c, ch�t này ki�m soỏt s�m�c và phỏt tri�n chung c�a cõy Arabidopsis. Nh�ng nghiờn c�u gõy ��t bi�n c�ng cho th�y r�ng BL (brassinolide) cú th� khụng ph�i lỳc nào c�ng c�n thi�t cho s�m�c và l�n lờn bỡnh thư�ng nhưng c�ng ch�ng minh r�ng cõy
Arabidopsis ��t �ư�c s� m�c và phỏt tri�n t�t hơn khi cú m�t BL. Nh�ng nghiờn c�u gõy ��t bi�n thi�u h�t BR c�a m�t s�tỏc gi�như Li và cs 1996, Fujioka và cs,1997, Choe và cs 1998, Bishop và cs 1999… �ó ch� ra r�ng thi�u h�t BR gõy ra s� gi�m chi�u dài c�a ch�i, gi�m ��phỡ nhiờu, ch�m già, làm bi�n��i s�v�n chuy�n cỏc mao m�ch và s� phỏt sinh quang hỡnh thỏị Ngư�i ta �ó xỏc d�nh �ư�c nh�ng gen bi�u th�cho s�sinh t�ng h�p BR. CYP 85A1, CYP 85A2, CYP90A1, CYP90B1 �ư�c tỡm th�y trong Arabidopsis. CYP 90D2 và CYP92A6 �ư�c xỏc ��nh cú m�t trong lỳa g�o và ��u m�t cỏch tương �ng.
Ngư�i ta c�ng ch�ng minh �ư�c r�ng m�t Arabidopsis Cyt- P450, CYP85A2, m�t BR-C-6 oxidase, c�ng cú kh�n�ng ho�t��ng nhưm�t BL synthase trong s�chuy�n húa CS thành BL.
CYP 85A1 và CYP85 A2 cú ho�t tớnh ��c hi�u cơ ch�t khỏc nhaụ Arabidopsis CYPP450 cà chua ch�a 2 lo�i CYP 85 (CYP85A1 và CYP85A2) tương t� nhau, chỳng chuy�n húa 6- deoxo CS thành CS,6-deoxoTY thành TY,6-deoxo 3DHT thành 3- DHT và 6-deoxoTE thành TẸ CYP85A1 và 85A2 �ư�c bi�u hi�n d�th�trong n�m men c�ng xỳc tỏc ph�n �ng oxy húa C-6 c�a BRs và cho th�y r�ng c� 2 lo�i CYP 85A1 và A2 ��u cú th� ho�t ��ng nhưBR C-6 oxydasẹ T�i sao Arabidopsis l�i cú 2 b� gen mó húa nh�ng enzyme cú cựng ch�c n�ng thỡ cho ��n nay ngư�i ta v�n chưa gi�i thớch �ư�c.
G�n �õy ngư�i ta �ó ch�ng minh �ư�c r�ng CS �ư�c sinh t�ng h�p t�cholesterol (CHR) qua cỏc C27-BR, nh�ng ch�t này cú cựng
Ch ng IV. H�th�ng Cytochrome-P450 �vi sinh v�t và th�c v�t 115 khung cacbon như là 28-norcastasterone (28-nor CS) trong cõy cà chua non. Hơn n�a ngư�i ta cũn ch�ng minh �ư�c r�ng 28-nor CS cú th� �ư�c chuy�n húa thành CS b�i m�t lo�i enzyme xỳc tỏc là sterolmethyltransferase ph� thu�c S-adenosyl-L-Methionine trong cõy cà chuạ Trong Arabidopsis s� chuy�n húa t� CHR thành cholestanol �ó �ư�c ch�ng minh (Nakajima và cs. 2002). Ngư�i ta c�ng xỏc ��nh �ư�c r�ng s� chuy�n húa t� 28-nor CS thành CS c�ng x�y ra �Aradopsis.�i�u này g�i ý r�ng con �ư�ng sinh t�ng h�p C27-BR t�CHR ��t�o ra CS c�ng di�n ra trong th�c v�t.
Cỏc k�t qu� nghiờn c�u ch�ra r�ng CYP85A1 và CYP85A2 cú ỏi l�c khỏc nhau v�i cỏc cơ ch�t C27-BRs và C28-BRs, m�c dự chỳng cựng cú kh�n�ng ho�t ��ng nhưBR C-6 oxidasẹ (Tae-Wuk Kim et al. 2005).
117
Ch ng V
NH NG GEN Cyt-P450 VÀ S BI U HI NC A CHÚNG