K. pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, Nhiễm khuẩn do pneumoniae còn hay
2.4.5.4. Tiến hành phản ứng PCR
* Mẫu chứng dương: nghiên cứu này sử dụng phương pháp PCR dựa trên nghiên cứu của tác giả Sylvain B. và Yeh K.M. [93], [106]. Chúng tôi đã sàng lọc, lựa chọn các chủng K. pneumoniae mang gen magA, rmpA và serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57. Sau đó giải trình tự các sản phẩm đã được nhân lên đó và so sánh các trình tự đó với dữ liệu trong ngân hàng gen thế giới (GenBank) để kiểm tra tính chính xác của sản phẩm PCR. ADN được tách chiết từ các chủng K. pneumoniae mang các gen magA, rmpA và serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57. Sau đó được sử dụng để làm đối chứng dương trong các lần chạy PCR tiếp theo.
* Mẫu chứng âm: là mẫu đối chứng âm, khuôn mẫu của phản ứng cho mẫu chứng âm là nước sử dụng trong sinh học phân tử. Trong tất cả các lần chạy PCR, mẫu chứng âm phải âm tính thì mới đảm bảo các mẫu khác là có kết quả chính xác.
* Mẫu MOCK: cũng là một mẫu chứng âm. Khi tách chiết ADN từ các chủng K. pneumoniae để làm mẫu chứng dương ở trên, chúng tôi cũng tiến hành tách chiết dung dịch đệm dùng để hòa loãng vi khuẩn làm chứng âm. Mẫu chứng âm này dùng để kiểm tra các mẫu khác trong quá trình tách chiết. Chúng tôi sử dụng mẫu MOCK là vì trong mỗi lần tách chiết ADN nhằm kiểm soát quá trình lây nhiễm chéo giữa các mẫu đồng thời kiểm tra các hóa chất được sử dụng trong quá trình chạy PCR. Mẫu MOCK phải âm tính trong tất cả các lần chạy PCR.
* Quy trình chạy PCR với các cặp mồi magA, rmpA và serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57 được dựa trên nghiên cứu của tác giả Kuo-Ming Y. và Sylvain B. [67], [93] đồng thời chúng tôi cũng tiến hành tối ưu hóa các quy trình này đế có được nồng độ của các chất thích hợp cho phản ứng PCR.
* Quy trình tối ưu hóa phản ứng PCR bao gồm như sau [25], [67], [93]: + Tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi: Sử dụng Gradient nhiệt độ để xác định nhiệt độ tối thích của phản ứng
+ Tối ưu hóa nồng độ các thành phần của phản ứng PCR để không xuất hiện dimer thừa.
+ Tối ưu nồng độ của ion Mg2+ xúc tác cho enzyme Taq polymease nhằm có được sản phẩm PCR lớn nhất.
* Cách pha PCR mix của rmpA, magA
Pha một master mix cho 100 PCR mix với thể tích phản ứng là 25 µl và thể tích mẫu cho vào PCR mix là 5 µl.
Hóa chất gốc Nồng độ gốc
Nồng độ trong 1 thể tích phản ứng
Thể tích phải lấy để pha master mix Nước khử ion 13,25 PCR buffer10X 10X 1X 2,5 MgCl2 25mM 1 Mm 1,0 DNTPs 10mM 0,4 mM 1,0 rmp Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 rmp Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 mag Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 Mag Primer R 10 µM 0,2µM 0,5
Hostar taq 5U/µl 1,25U 0,25
Tổng số 20,0
* Tiến hành:
Thứ tự Các bước PCR thường
1 Trong phòng sạch, xả đá tất cả các thuốc thử (ngoại trừ Hostar Taq) và ly tâm trước khi mở các ống.
Hostar Taq được lấy ra khỏi tủ lạnh -200C trước khi sử dụng
2 Chuẩn bị týp 1,5 ml để hút các hóa chất PCR thường và mồi
rmpA, magA vào, trộn bằng máy quay tròn loại nhỏ (dung dịch I) 3 Chuẩn bị các týp 0,2 ml
4 Hút 20 µl dung dịch (I) vào mỗi týp 0,2 ml
5 Trong phòng tách chiết, các mẫu ADN được làm tan và quay tròn bằng máy quay tròn trước khi mở nắp các týp
6 Hút 5 µl mẫu AND vào mỗi týp 0,2 ml (khi hút sử dụng đầu col có màng lọc)
7 Chạy chương trình PCR thường
8 Hút 10 µl sản phẩm PCR chạy điện di gel bằng agarose 1,5% sau đó phân tích và giải thích kết quả
+ Chương trình luân nhiệt chạy PCR rmpA, magA:
- 35 chu kỳ: 950C/30 giây 500C/30 giây 720C/30 giây - 1 chu kỳ: 720C/10 phút - Giữ ở: 40C
+ Giải thích và báo cáo kết quả: - Kết quả PCR dương tính:
Chứng âm: Âm tính không có ADN; Chứng dương: Dương tính;
Mẫu: Dương tính. - Kết quả PCR âm tính
Chứng âm: Âm tính không có ADN;
Chứng dương: Dương tính;
Mẫu: Âm tính.
- Không trả kết quả PCR trong trường hợp: Chứng âm: Dương tính;
Chứng dương: Âm tính.
- Kết quả nghi ngờ thì phải thực hiện lại phản ứng: khi chứng âm hoặc chứng dương không lên kết quả hoặc cả chứng dương, chứng âm không lên kết quả khi chạy điện di thì phải chạy lại PCR rồi mới trả kết quả.
Hóa chất gốc Nồng độ gốc
Nồng độ trong 1 thể tích phản ứng
Thể tích phải lấy để pha master mix
Nước khử ion 9,25 PCR buffer10X 10X 1X 2,5 MgCl2 25mM 3 mM 3,0 DNTPs 10mM 0,4mM 1,0 K1 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K1 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 K2 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K2 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 K5 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K5 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 K20 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K20 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 K54 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K54 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5 K57 Primer F 10 µM 0,2µM 0,5 K57 Primer R 10 µM 0,2µM 0,5
Hostar taq 5U/µl 1,25U 0,25
Tổng số
22,0
Thứ tự Các bước PCR thường
