K. pneumoniae thay đổi con đường chuyển hoá làm cho kháng sinh không can thiệp vào quá trình chuyển hoá của vi khuẩn pneumoniae kháng
1.2.4.2. Nuôi cấy phân lập
K. pneumoniae là loài vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ngộ, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như môi trường thạch thường,
thạch máu. Nhiệt độ thích hợp từ 35 - 37oC, pH từ 7 - 7,2. Sau 24 giờ trên môi trường đặc, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc to, nhầy, màu xám. Dùng que cấy tách khuẩn lạc từ mặt thạch có thể thấy sợi dính dài trên 5 mm giữa que cấy và khuẩn lạc.
Bệnh phẩm máu: cấy vô trùng vào canh thang BHI.
Các bệnh phẩm khác: dịch mủ, dịch não tủy, dịch màng phổi, nước tiểu… cấy vào môi trường phân lập thạch máu, mac conkey, sô cô la, endo, uriselect.
Trong môi trường canh thang BHI, vi khuẩn mọc nhanh và đục đều, sau 24 giờ sẽ tạo lắng cặn dưới đáy ống nghiệm, cặn thường rất nhày.
Trên môi trường thạch máu, mac conkey: vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc dạng M, màu xám, nhày.
Trên môi trường endo: khuẩn lạc dạng M (có thể dạng R), màu tím, đường kính 3 - 4 mm.
Trên môi trường uriselect: khuẩn lạc dạng S, màu xanh, đường kính 3 - 4 mm, có thể gặp một số khuẩn lạc dạng R [7], [16].
K. pneumoniae lên men và sinh hơi trên nhiều loại đường như: glucose, galactose, saccarose, mantose, lactose, manit. Phản ứng oxydase (-), urease (+), catalase (+), citrat (+), phản ứng VP và indol có thể (+/-), ornithin decarboxylase (-), arginin decarboxylase (-), lysin decarboxylase (+), H2S (-) [15].
* Kỹ thuật kháng sinh đồ
Các chủng K. pneumoniae để nhạy cảm với kháng sinh theo phương pháp kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch, đồng thời xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) bằng máy tự động VITEK 2 - Compact.
- Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có mức độ nhậy cảm với các loại kháng sinh khác nhau, biểu hiện của sự khác nhau đó bằng đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với khoanh giấy kháng sinh.
- Chuẩn bị: chủng vi khuẩn thuần 18 - 24 giờ, thạch Muller-Hinton, khoanh giấy kháng sinh và dụng cụ chuyên khoa.
- Các bước tiến hành:
• Chuẩn bị môi trường: chuẩn bị thạch theo các kỹ thuật pha chế đã hướng dẫn. Các đĩa thạch phải đạt độ dày 4 ± 0,5 mm và bề mặt phẳng;
• Pha hỗn dịch vi khuẩn: từ đĩa nuôi cấy thuần chủng mọc qua đêm, dùng que cấy vô trùng chấm vào 10 khuẩn lạc (giống nhau) để có một ăng đầy và hòa tan vào 1ml nước muối 9‰. So sánh với độ đục Mc Farland 0,5 để có nồng độ 108 vi khuẩn/ml;
• Cấy vi khuẩn: làm khô mặt thạch trước khi cấy (để đĩa thạch 15 phút trong tủ ấm). Dùng tăm bông nhúng vào hỗn dịch 108 vi khuẩn/ml. Ria đều lên mặt thạch, sau đó quay 1800 và ria lại;
• Đặt khoanh giấy kháng sinh: dùng panh đầu nhọn hoặc kim tiêm vô trùng đặt các khoanh giấy theo tiêu chuẩn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute 2007);
• Sau đó để ở nhiệt độ phòng 30 phút để kháng sinh khuyếch tán vào thạch trước khi ủ ấm;
• Ủ ấm ở 350 C, sau 18 - 24 giờ đọc kết quả.
- Cách đọc kết quả: theo quy định chung, người ta phân loại độ nhạy cảm của vi khuẩn thành 3 mức độ.
• Nhậy cảm S (Sensitive): xung quanh khoanh giấy kháng sinh có vòng vô khuẩn rộng;
• Nhậy cảm vừa I (Intermediate): xung quanh khoanh giấy kháng sinh có vòng vô khuẩn trung bình;
• Đề kháng R (Resistance): xung quanh khoanh giấy kháng sinh không có vòng vô khuẩn hoặc có nhưng rất hẹp;
• Dùng thước chia mm để đo đường kính vòng vô khuẩn ở mặt sau của đĩa thạch. Nếu mép vô khuẩn không rõ thì đo tới vùng vô khuẩn khoảng 80%, đối chiếu với hướng dẫn của CLSI [13], [42].
- Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu - MIC:
• Nguyên lý: Cấy chủng vi khuẩn lên môi trường nuôi cấy có chứa các nồng độ kháng sinh khác nhau, quan sát xem chủng vi khuẩn không phát triển được ở nồng độ kháng sinh nào.
• Phương pháp phát hiện ESBLs [42], [46]
Nguyên lý: thay đổi pH (acidimetric) hoặc thay đổi màu của hỗn hợp tinh bột iode (iodometric) hoặc thay đổi màu của cơ chất bị biến đổi dưới tác động của β- lactamase (Chromogenic).
