K. pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, Nhiễm khuẩn do pneumoniae còn hay
2.4.5.2. Tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn K.pneumoniae
Bảng 2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết AND
Hóa chất Hãng sản xuất Bảo quản
Týp có chứa 1,15ml gel 5 PRIME Nhiệt độ phòng
BHI Biomerieux Nhiệt độ phòng
PBS PH 7.4 Sigma Nhiệt độ phòng
SDS Sigma Nhiệt độ phòng
Proteinase K (20mg/ml) Sigma -20oC
Phenol Sigma Nhiệt độ phòng
Chloroform:isoamylalcohol (24:1) Sigma Nhiệt độ phòng
Sodium Acetate Sigma Nhiệt độ phòng
Absolute Ethanol Sigma Nhiệt độ phòng
Acetic Acid Sigma Nhiệt độ phòng
MG H20 Sigma Nhiệt độ phòng
* Nguồn: theo Phạm Hùng Vân (2009) [25]; Manual Phase Lock Gel (2007) [75]
* Dụng cụ:
+ Pipet và đầu côn các loại: 10 µl, 20 µl, 200 µl và 1000 µl; + Týp vô trùng eppendorf;
+ Ống falcol; + Vortex;
+ Máy quay tròn loại nhỏ;
+ Máy ly tâm loại nhỏ (với rotor cho týp 1,5 ml hoặc 2 ml).
* Tiến hành
Bảng 2.2. Các bước tiến hành tách chiết ADN
Thứ tự Các bước tiến hành tách chiết ADN
1 Hút 100µl vi khuẩn được giữ trong ống falcol loại 50ml có chứa 5ml BHI và đem ủ 370C qua đêm
2 Ly tâm 4500 vòng trong 10 phút 3 Bỏ nước nổi
4 Thêm 2 ml PBS pH7.4 5 Thêm 250ul của SDS 20% 6 Và 25ul proteinase K 20 mg/ml 7 Ủ 370C trong 2 giờ để ly giải tế bào
8 Chuyển sang týp eppendorf loại 15ml và thêm một thể tích tương đương phenol/chloroform và trộn nhẹ nhàng cho đến khi tan đều
9 Ly tâm 4500 vòng x 2 phút, lấy nước nổi chuyển sang týp mới 10 Chuyển sang týp eppendorf loại 15ml và thêm một thể tích
tương đương phenol/chloroform và trộn nhẹ nhàng cho đến khi tan đều và thêm một khối lượng chloroform: isoamyl alcohol theo tỷ lệ (24:1) và trộn nhẹ nhàng cho đến khi tan đều
11 Ly tâm 4500 vòng và lấy nước nổi chuyển sang týp eppendorf loại 15ml
12 Thêm sodium acetate (pH5.2) 3M theo tỷ lệ 1/10
13 Thêm 2,5 khối lượng ethanol và đảo ngược týp nhẹ nhàng cho
đến khi xuất hiện ADN kết tủa
14 Hút bỏ nước nổi lấy cặn
15 Thêm ethanol 70% trong 5 phút 16 Làm khô cặn trong 5-10 phút 17 Hòa cặn ADN trong 0,5ml nước
* Nguồn: theo Phạm Hùng Vân (2009) [25]; Manual Phase Lock Gel (2007) [75]
