1: Alcaloid toaøn phaàn töø dòch EtOAc; 2: Alcaloi dS keát tinh ñöôïc
3.5.2. Khaûo saùt quy trình ñònh löôïng treân naringin chuaån
Chọn bước sóng định lượng
Pha 1 dung dịch mẹ của naringin trong MeOH có nồng độ 1mg/ml (25 mg/25 ml). Lấy 1 ml dung dịch này pha loãng với MeOH thành 25 ml để có dung dịch đo với nồng độ 40 g/ml. Quét phổ UV-VIS dung dịch này từ 200 – 400 nm, mẫu trắng là MeOH.
Nhận xét: Kết quả 6 lần đo cho thấy naringin có 2 λmax là 283 nm và 331 nm. Ở đây ưu tiên chọn max = 283 nm vì ổn định và cho đỉnh hấp thu cực đại cao hơn, sai số cho phép là 1 nm. Vậy bước sóng định lượng được chọn là 283 nm 1 nm với E (1%, 1cm) = 315.
Xác định khoảng tuyến tính
- Dung dịch mẹ: 0,5 mg naringin / ml MeOH (25mg naringin / 50 ml MeOH)
- Dung dịch đo: Từ dung dịch mẹ pha một dãy các dung dịch đo có nồng độ từ
thấp đến cao (0,99-168,3 g/ml) bằng cách lấy tăng dần thể tích dung dịch mẹ bằng micropipet và pipet, sau đó pha loãng với MeOH trong bình định mức 25 ml. Đo độ hấp thu (A) của giai mẫu ở 283 nm. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của dung dịch naringin
Dung dịch mẹ Nồng độ dd đo (g /ml)
Độ hấp thu (A) 0.05 ml (50 l) 0,99 0,040 0.15 ml (150 l) 2,97 0,100 0.25 ml (250 l) 4,95 0,166 0,5 ml 9,90 0,321 1,5 ml 29,70 0,957 2,5 ml 49,50 1,589 3,5 ml 69,30 2,189 4,5 ml 89,10 2,613 5,5 ml 108,90 2,834 6,5 ml 128,70 2,960 7,5 ml 148,50 2,960 8,5 ml 168,30 2,872
Tính toán phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan của các nồng độ định lượng. Kết quả cho thấy:
- Ở dãy nồng độ 0,99 – 168,3 g /ml, phương trình hồi quy 1 có dạng: Y1 = 0,0222x + 0,2226 và R2 = 0,9403.
- Ở dãy nồng độ 0,99 – 108,9 g /ml, phương trình hồi quy 2 có dạng: Y2 = 0,0276x + 0,0793 và R2 = 0,9861
- Ở dãy nồng độ 0,99 – 69,3 g /ml, phương trình hồi quy 3 có dạng: Y3 = 0,03x + 0,01 và R2 = 0,9999
Để khảo sát mức độ phân tán của các giá trị đo và chọn dãy nồng độ phù hợp làm khoảng tuyến tính cho định lượng, chúng tôi lập bảng 3.20 để tính hiệu số giữa độ hấp thu thực nghiệm và độ hấp thu lý thuyết dựa trên các phương trình hồi quy ở trên.
Bảng 3.20. Khảo sát độ phân tán của giá trị đo Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thu thực nghiệm
Phương trình 1 Phương trình 2 Phương trình 3
Độ hấp thu lý thuyết
Δ* Độ hấp thu lý thuyết
Δ* Độ hấp thu lý thuyết Δ* 0,99 0,04 0,245 -0,205 0,107 -0,067 0,04 0 2,97 0,1 0,289 -0,189 0,161 -0,061 0,1 0 4,95 0,166 0,332 -0,166 0,216 -0,05 0,16 0.006 9,9 0,321 0,442 -0,121 0,353 -0,032 0,31 0,011 29,7 0,957 0,882 0,075 0,899 0,058 0,91 0,047 49,5 1,589 1,322 0,268 1,446 0,144 1,51 0,079 69,3 2,189 1,761 0,428 1,992 0,197 2,11 0,079 89,1 2,613 2,201 0,412 2,538 0,075 - - 108,9 2,834 2,640 0,194 3,085 -0,251 - - 128,7 2,96 3,080 -0,120 - - - - 148,5 2,96 3,519 -0,559 - - - - 168,3 2,872 3,959 -1,087 - - - -
Δ* Hiệu số giữa độ hấp thu thực nghiệm và độ hấp thu lí thuyết
y = 0.0222x + 0.2226R2 = 0.9403 R2 = 0.9403 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 50 100 150 200
Phương trình hồi quy: Y1= 0,0222x + 0,2226; R2 = 0,9403 (Biểu đồ 3.1a)
y = 0.0276x + 0.0793R2 = 0.9861 R2 = 0.9861 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 20 40 60 80 100 120
y = 0.0316x + 0.0103R2 = 0.9999 R2 = 0.9999 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 20 40 60 80
Phương trình hồi quy: Y3 = 0,03x + 0,01; R2 = 0,9999 (Biểu đồ 3.1c)
Biểu đồ 3.1. ab c. Mối tương quan giữa nồng độ naringin và độ hấp thu (A)
Nhận xét:
Trong khoảng nồng độ từ 0,99 – 168,3 g/ml, phương trình hồi quy có dạng Y = 0,0222x + 0,2226 với R2 = 0,9403 (khá thấp). So sánh các dữ liệu trong bảng 3.20 cho thấy tất cả các kết quả thực nghiệm đều cho sai số so với các kết quả lý thuyết. Điều này chứng tỏ phương trình định lượng không phải là bậc nhất và do vậy không phản ánh đúng định luật Beer – Lambert. Do đó chúng tôi tính toán lại phương trình hồi quy với khoảng nồng độ thấp hơn.
Kết quả trong dãy nồng độ từ 0,99 – 108,9 g/ml, phương trình hồi quy Y = 0,0276 + 0,0793 với R2 = 0,9861 tốt hơn, sai số còn nhưng gần giữa lý thuyết và thực nghiệm.
Ở dãy nồng độ thấp hơn từ 0,99- 69,3 g/ml, phương trình hồi quy có dạng Y = 0,03x + 0,01 với R2 = 0,9999 (khá cao). Kết quả cho thấy sai số giữa lý thuyết và thực nghiệm nhỏ, thể hiện sự tuyến tính cao. Do vậy, phương trình này được chọn cho các tính toán về sau.
Độ lặp lại của dung dịch đo
Pha 6 mẫu đo có nồng độ khoảng 40 μg naringin /ml như ở mục chọn bước sóng định lượng. Đo độ hấp thu ở 283 nm. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.21
naringin STT Độ hấp thu (A) Nồng độ pha (μg /ml)
Nồng độ đo (μg /ml)
Xử lý thống kê (n = 6) (P = 0,95) 1 1,273 41,00 42,10 X = 41,67 2 1,246 41,00 41,20 SD = 0,634 3 1,285 41,28 42,50 RSD = 1,52% 4 1,243 40,08 41,10 e = 0,665 5 1,241 40,64 41,03 µ = 42,06 0,665 6 1,273 41,12 42,10
Nhận xét: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao (RSD = 1,52%)
Khảo sát tính tương thích của thiết bị đo UV
Để đánh giá độ chính xác của thiết bị đo, pha 1 mẫu thử có nồng độ khoảng 40 μg naringin/ml, đo độ hấp thu ở 283 nm, lập lại 6 lần. Kết quả được ghi nhận trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Khảo sát tính tương thích của thiết bị đo UV
STT Độ hấp thu A Xử lý thống kê (P = 0,95 và n = 6)
1 1,273 X = 1,272 2 1,272 SD = 0,002 3 1,275 RSD = 0,195% 4 1,273 e = 0,003 5 1,270 = 1,272 0,003 6 1,268
Nhận xét: Thiết bị đo có độ lặp lại cao (RSD = 0,195%)
Khảo sát động học của dung dịch chuẩn (độ ổn định của A)
Pha dung dịch chuẩn naringin có nồng độ 40 μg/ml MeOH. Theo dõi độ hấp thu của dung dịch chuẩn ở 283 nm theo từng khoảng thời gian cố định (10 phút) và kéo dài trong 4 giờ (Biểu đồ 3.2; Bảng 3.23).
Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch chuẩn theo thời gian Bảng 3.23. Khảo sát sự thay đổi của độ hấp thu theo thời gian của dd chuẩn
Thời gian (phút)
Độ hấp thu (A)
Thời gian (phút)
Độ hấp thu (A)
Thời gian (phút)
Độ hấp thu (A) 0 1,0150 80 1,0137 160 1,0201 10 1,0026 90 1,0111 170 1,0237 20 1,0093 100 1,0140 180 1,0203 30 1,0122 110 1,0156 190 1,0175 40 1,0079 120 1,0234 200 1,0240 50 1,0140 130 1,0110 210 1,0238 60 1,0138 140 1,0176 220 1,0236 70 1,0143 150 1,0214 230 1,0220
Nhận xét: Độ hấp thu của dung dịch chuẩn thay đổi hầu như không đáng kể trong
khoảng thời gian 4 giờ. Do đó, việc định lượng naringin có thể tiến hành ổn định trong khoảng thời gian 4 giờ.
Tóm tắt kết quả: Đã khảo sát được các điều kiện định lượng naringin trong dung
dịch bằng phương pháp đo UV ở bước sóng 283 nm, với khoảng tuyến tính 0,99 – 69,3μg /ml, độ lặp lại cao với RSD = 1,52% và thời gian có thể định lượng là 4 giờ .