CHÖÔNG 4: BAØN LUAÄN
4.4. XAÂY DÖÏNG PHÖÔNG PHAÙP ÑÒNH LÖÔÏNG
Chúng tôi đã khảo sát và xây dựng được 3 phương pháp định lượng: quang phổ UV-Vis, HPLC và CE, một kỹ thuật phân tích khá hiện đại, để đánh giá hàm
lượng naringin và hesperidin trong vỏ quả các loại Cam, Chanh, Quít và Bưởi.
Các phương pháp này xác định trực tiếp hàm lượng hesperidin và naringin nhờ thông qua việc sử dụng một số kỹ thuật như rửa loại tạp hoặc dùng cột SPE, cột pha đảo. Các phương pháp này đã đáp ứng tốt các yêu cầu về độ tương quan tuyến tính, độ ổn định của độ hấp thu, độ lặp lại và độ đúng. Tùy theo điều kiện về trang thiết bị ở địa phương mà có thể áp dụng phương pháp UV-Vis, phương
pháp HPLC hoặc là phương pháp CE.
Trong định lượng naringin bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis, bột dược liệu được chiết bằng MeOH nóng, cho dịch chiết qua cột SPE, loại tạp kém phân cực bằng hệ dung môi CHCl3 – MeOH (9:1), thu phân đoạn giàu naringin bằng hệ dung môi CHCl3 – MeOH (8:2), bốc hơi phân đoạn naringin đến cắn, hoà lại trong MeOH và đo độ hấp thu UV ở bước sóng 283 nm. Kết quả được tính thông qua đường cong chuẩn, xây dựng bởi 1 dãy dung dịch chuẩn naringin có nồng độ từ 1 – 70 µg / ml. Phương pháp này định lượng trực tiếp naringin trong dược liệu, độ lặp lại, độ đúng và độ ổn định của độ hấp thu đều cao. Trên thực tế áp dụng cho thấy hàm lượng naringin trong vỏ bưởi Năm roi chín nằm trong khoảng (2,2 – 3,5%); bưởi Năm roi non từ (6,9 – 9,1%); bưởi Da xanh chín từ (2,2 – 5%); bưởi Da xanh non từ (8,4 – 11,2%). Như vậy hàm lượng naringin ở mẫu non luôn cao hơn hàm lượng naringin ở mẫu chín, phù hợp với kết quả của các tài liệu đã công bố.
Trong định lượng hesperidin bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis, bột dược liệu được chiết bằng MeOH nóng, loại dung môi, rửa cắn với nước để loại tạp, hoà cắn trong dung dịch NaOH 0,5% trong MeOH 75%, đo độ hấp thu ở 361 nm. Kết quả được tính thông qua đường cong chuẩn, xây dựng bởi 1 dãy dung dịch chuẩn hesperidin có nồng độ từ 10 – 130 µg / ml dung dịch NaOH 0,5% / MeOH 75%. Phương pháp này cũng định lượng trực tiếp hesperidin trong dược liệu do các tạp chất đã bị loại đi trong quá trình rửa và đã đáp ứng tốt các yêu cầu về độ lặp lại, độ đúng và độ ổn định của độ hấp thu. Kết quả định lượng trên các mẫu dược liệu cho thấy hàm lượng hesperidin trong các loại Cam thay đổi từ (2,2 – 5,6%); Chanh từ (1,80 – 6,00%); Quít (5,1%) và Thanh bì (15,60%), là mẫu có hàm lượng hesperidin cao vượt trội.
Phương pháp do chúng tôi đề xuất có nhiều điểm khác biệt so với phương pháp đo màu của David, phương pháp đo phổ UV của Hendrickson hoặc phương pháp đo màu thông qua phản ứng Cyanidin. Ở phương pháp David, việc đo phổ được thực hiện ở bước sóng 420 nm sau khi cho dịch chiết tác dụng với NaOH 4N rồi pha loãng trong diethylene glycol. Phương pháp này không có tính chuyên biệt, chỉ tính được hàm lượng flavonoid toàn phần theo naringin hoặc theo hesperidin và có một số hạn chế như sự kém tan của hesperidin chuẩn trong nước và độ hấp thu yếu của hesperidin chalcon ở 420 nm [78]. Ở phương pháp đo phổ UV của Hendrickson, naringin trong dịch quả Bưởi được đo ở bước sóng 290 và 295 nm và hesperidin trong dịch quả Cam ở bước sóng 290 và 300 nm với dung môi là isopropanol. Naringin chuẩn được pha trong isopropanol nhưng hesperidin chuẩn lại được pha trong nước, là điểm bất hợp lý nhất của quy trình vì hesperidin vô cùng kém tan trong nước. Ở phương pháp đo màu thông qua phản ứng Cyanidin (Mg / HCl đđ), tác nhân khử (hydrogen mới sinh) trong phản ứng này quá mạnh, do đó rất dễ có thêm các sản phẩm phụ do sự khử hoá xa hơn tạo ra như catechin. Điều này làm cho độ hấp thu khó ổn định được.
Trong định lượng naringin và hesperidin bằng phương pháp HPLC, bột dược liệu được chiết bằng MeOH nóng, pha loãng 10 lần trước khi bơm mẫu. Việc phân tích bằng HPLC được thực hiện trên cột pha đảo Discovery HS-C18 (250mm x 4,6mm, i.d; 5µm tiểu phân), pha động là hỗn hợp acetonitril – acid acetic 0,1% trong nước (25:75, v/v), rửa giải theo chế độ isocratic, tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ cột 35 oC, chuẩn nội là rutin, phát hiện đỉnh flavonoid bằng detector UV ở bước sóng 283 nm, có khoảng tuyến tính nằm trong khoảng 25 – 125 µg / ml. Kết quả định lượng naringin cho thấy: vỏ Bưởi chín thay đổi từ (2,8 - 5,5%); vỏ Bưởi non từ (6,1 – 16%). Kết quả định lượng hesperidin cho thấy: vỏ Cam chín (4,3 – 7,4%); vỏ Cam non (8,3 – 10,3%); vỏ Chanh chín (1,5 – 3,2%); vỏ Chanh
non (3,4 – 4, 4%); vỏ Quít chín (3,7 – 5,2%); vỏ Quít non (7,0 – 10,0%); Thanh bì (23,4%). Qua so sánh cũng cho thấy hàm lượng naringin và hesperidin ở quả non cũng luôn cao hơn ở quả chín, đặc biệt Thanh bì có hàm lượng hesperidin cao vượt trội, điều này cũng phù hợp với kết quả của một số tài liệu đã công bố [58,63].
Trong định lượng naringin và hesperidin bằng phương pháp CE, bột dược liệu được chiết bằng MeOH nóng, pha loãng 10 lần trước khi bơm mẫu. Việc phân tích bằng CE được thực hiện trên cột mao quản (dài 57 cm; d = 75 µm, chiều dài đến detector là 50 cm), điện thế áp đặt 20 kV, nhiệt độ cột 25 oC, dung dịch đệm là Borax (35 mM, pH 9,4), có 0,03% HEC (hydroxyethyl cellulose), dùng mode CZE, chạy theo chế độ đảo cực, chuẩn nội là rutin, phát hiện đỉnh flavonoid bằng detector UV ở bước sóng 214 nm. Kết quả định lượng naringin cho thấy: vỏ Bưởi chín thay đổi từ (1,8 - 5,2%); vỏ Bưởi non từ (6,1 – 14,1%). Kết quả định lượng hesperidin cho thấy: vỏ Cam chín (3,3 – 6,9%); vỏ Cam non (7,3 – 8,9%); vỏ Chanh chín (1,5 – 2,2%); vỏ Chanh non (2,5 – 2,7%); vỏ Quít chín (3,1 – 3,3%); vỏ Quít non (6,8 – 8,2%); Thanh bì (23,4%). Kết quả cũng cho thấy quả non có hàm lượng naringin và hesperidin cao hơn ở quả chín. Riêng ở quả Chanh thì sự khác biệt lại không đáng kể.
Đánh giá hàm lượng naringin và hesperidin từ vỏ quả Citrus ở Việt Nam bằng
phương pháp HPLC và CE có thể được xem là một vấn đề mới của đề tài vì cho đến nay chúng tôi chưa thấy tác giả nào trong nước công bố về vấn đề này. Mặc dù các tạp chí chuyên ngành nước ngoài cũng đã có nhiều công bố về định lượng
flavonoid Citrus bằng HPLC và CE nhưng phần lớn tập trung vào flavonoid từ
dịch quả có nguồn gốc chủ yếu ở châu Aâu và châu Mỹ. Điều kiện phân tích HPLC và CE cũng có nhiều điểm khác biệt như về pha động, loại cột, bước
sóng phát hiện , dung dịch đệm sử dụng và điện thế áp đặt. Đặc biệt phương pháp CE hiện nay được xem là 1 phương pháp có nhiều thế mạnh trong lĩnh vực phân tích do có độ nhạy cao và đặc biệt là gần như rất ít tốn dung môi khi so với phương pháp HPLC.