4.2.1. Khái niệm về epitope
Bất kỳ một polypeptit hay protein phức hợp nào có hoạt tắnh sinh học cao ựều có cấu trúc phức tạp, thông thường chúng có cấu trúc gấp khúc, mà người ta thường gọi là cấu trúc không gian ba chiều (three-dimensional protein = 3ỜD protein).
Protein có cấu trúc không gian 3 chiều thường là những polypeptit có cấu trúc bậc hai, bậc ba hoặc thậm chắ bậc bốn; ựó chắnh là các mạch polypeptit cuộn vòng tạo thành từng cụm, từng mảng xoắn vào nhau.
Tạo hình không gian (conformation) hay sự gấp khúc (folding) là một quá trình sau tổng hợp (postỜtranslational process), cho nên quá trình này phụ thuộc vào nhiều ựiều kiện môi trường, nơi mà sợi polypeptit ựã ựược tổng hợp ra.
Dĩ nhiên, do có cấu trúc gấp khúc, nên bề mặt của protein không bằng phẳng mà có dạng hình lồi, lõm, có hốc lõm vào và có mấu lồi ra.
Những vùng lồi lõm nằm trên protein chịu trách nhiệm về tắnh kháng nguyên, ựược gọi là ựiểm quyết ựịnh kháng nguyên (antigenỜdeterminant) hay còn gọi là epitope.
Mỗi một protein kháng nguyên có thể chỉ có 1 epitope, nhưng cũng có thể có nhiều
epitope khác nhau.
Thông thường các protein ựược coi là kháng nguyên ựều có khả năng kắch thắch sinh kháng thể. Chúng ta cần phân biệt 2 khái niệm về loại kháng thể: kháng thể ựa dòng và kháng thể ựơn dòng.
Kháng thể ựa dòng là kháng thể do nhiều epitope kháng nguyên kắch thắch sinh ra, do vậy chúng có khả năng kết hợp với nhiều epitope trong phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ41
Kháng thể ựơn dòng (monoclonal antibody = Mab) là do duy nhất một epitope kắch thắch sinh ra và chỉ kết hợp duy nhất với epitope ựó.
Trong tự nhiên, kháng thể do vaccine kắch thắch hoặc bị bệnh qua khỏi mà hình thành là kháng thể ựa dòng.
Muốn có kháng thể ựơn dòng phải có phương pháp sản xuất và thu nhận ựặc biệt, trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm.
Như vậy, mỗi một epitope là một phần nhất ựịnh của chuỗi polypeptit kháng nguyên, bao gồm khoảng vài chục axit amin, mà ở ựó, có một số axit amin (thông thường không quá 12 - 20 axit amin), trong ựó có một vài axit amin cực kỳ quan trọng gọi là axit amin làm khung, số còn lại là axit amintrợ giúp hay còn gọi là axit amin làm nền, tất cả tạo nên một bộ phận ựặc hiệu quyết ựịnh tắnh kháng nguyên và khả năng miễn dịch.
Epitope, xét về góc ựộ miễn dịch, là vị trắ mà kháng thể ựặc hiệu sẽ liên kết tạo nên phức hợp kháng nguyên - kháng thể.
Bất kỳ một ựột biến nào xảy ra trong chuỗi nucleotit của epitope mà làm thay ựổi axit amin khung, sẽ làm cho epitope thay ựổi cấu trúc, và do ựó, epitope lúc này không còn là epitope thế hệ trước dẫn ựến thay ựổi tắnh kháng nguyên và ựộc lực.
Phương pháp ựơn giản nhất phát hiện epitope là tạo kháng thể ựơn dòng (monoclonal antibody, gọi là Mab) với các khung epitope có nguồn gốc từ các chủng virus khác nhau, và dựa vào ựặc tắnh là Mab nào sẽ có phản ứng ựặc hiệu riêng biệt với epitope
của chúng, ựể phát hiện epitope tương ứng.
Hình 4-3. Minh họa epitope kháng nguyên 4.2.2. Một số ựịnh nghĩa cơ bản
Trong quá trình phân tắch biến ựổi epitope, một số thuật từ, thuật ngữ và khái niệm cơ bản sẽ ựược sử dụng, do vậy trước hết chúng ta cùng tìm hiểu một số ựịnh nghĩa có tắnh chất cơ bản:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ42 Epitope: Epitope là một vùng gồm nhiều axit amin, trong ựó có một số axit amin khung, hợp nhất thành một cấu trúc; quyết ựịnh ựặc tắnh kháng nguyên của một loại protein hoạt tắnh cao.
điểm quyết ựịnh epitope (epitopic determinants): Là một số hay một dãy axit amin ựược một hay nhiều kháng thể ựơn dòng nhận biết. Sự có mặt của các axit amin này quyết ựịnh ựặc tắnh sinh học của ựiểm quyết ựịnh kháng nguyên và qua ựó quyết ựịnh ựặc tắnh cơ bản của epitope nói chung. điểm quyết ựịnh epitope ựược xác ựịnh bằng ựộ tương ựồng axit amin (amino acidss identity) và vị trắ của dãy axit amin ựó, trong vùng epitope, qua so sánh ựối chiếu với nhiều chủng khác.
điểm quyết ựịnh epitope di truyền (genetic epitope determinants): điểm quyết ựịnh epitope di truyền là thành phần nucleotit mã hoá các axit amin của ựiểm quyết ựịnh epitope và của vùng epitope nói chung. Xác ựịnh ựột biến nucleotit trong vùng này bằng phương pháp so sánh ựối chiếu tìm giá trị tương ựồng (nucleotide identity).
Epitope cấu trúc (conformational epitope): Epitope cấu trúc là cấu hình không gian của một số axit amin tạo nên epitope do polypeptit kháng nguyên gấp khúc tạo nên không gian 3 chiều (three dimensional structure). Cấu hình không gian quyết ựịnh mức ựộ kháng nguyên và khả năng liên kết với kháng thể. Cùng số axit amin ựó, nếu có cấu hình không gian phù hợp, sẽ tăng tắnh kháng nguyên và miễn dịch, nếu có cấu hình không gian không phù hợp hoặc không có, sẽ làm giảm hoặc mất tắnh kháng nguyên và miễn dịch.
Tập hợp epitope (Epitopic determinant region): Tập hợp epitope là một vùng giới hạn trong chuỗi polypeptit kháng nguyên mà trong ựó có một vài epitope, hoặc có các ựiểm quyết ựịnh epitope phản ứng với một hay nhiều Mab khác nhau (vắ dụ, ở virus Gumboro ựó chắnh là vùng Ộsiêu biến ựổiỢ của protein kháng nguyên VP2).
Epitope kháng nguyên và ựộc lực: Nhiều protein có tắnh kháng nguyên của vi sinh vật (ựặc biệt là ở virus) vừa quyết ựịnh tắnh gây bệnh (ựộc lực) vừa quyết ựịnh tắnh kháng nguyên (kắch thắch miễn dịch). Epitope của protein kiểu này là vùng cùng một lúc có cả 2 chức năng (lưỡng năng), do vậy epitope của vùng này ựược gọi là epitope kháng nguyên và ựộc lực. (Vắ dụ, ở virus Gumboro epitope ở vùng Ộsiêu biến ựổiỢ của protein VP2).
Câu hỏi ôn tập:
1. Kháng nguyên là gì? Các ựặc tắnh của kháng nguyên?
2. Tắnh kắch thắch sinh miễn dịch của kháng nguyên phụ thuộc vào các ựiều kiện nào? 3. Trình bày tắnh ựặc hiệu của kháng nguyên? Hiện tượng cạnh tranh giữa các kháng nguyên? 4. Các căn cứ ựể phân loại kháng nguyên? Theo mỗi căn cứ có những loại kháng nguyên
nào?
5. Khái niệm về Epitope kháng nguyên? Một số ựịnh nghĩa cơ bản về Epitope kháng nguyên?
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ43
Chương 5
KHÁNG THỂ DỊCH THỂ (ANTIBODY)
đọc chương này người ựọc cần nắm ựược thế nào là kháng thể dịch thể, ựặc tắnh, các loại, cấu trúc, quy luật hình thành kháng thể dịch thể. Ảnh hưởng của kháng nguyên ựến sự hình thành kháng thể, cơ chế hình thành kháng thể dịch thể ựặc hiệu. Thế nào là kháng thể ựơn dòng và phương pháp sản xuất kháng thể ựơn dòng. Cơ chế phân tử của sự hình thành kháng thể.
5.1. đẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG THỂ DỊCH THỂ 5.1.1. định nghĩa
Kháng thể dịch thể ựặc hiệu là các chất dịch thể sinh học hòa tan trong huyết thanh và trong chất dịch của cơ thể khi bị kháng nguyên kắch thắch và có khả năng kết hợp ựặc hiệu với kháng nguyên ựã kắch thắch sinh ra chúng, khi ựó phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra và kháng nguyên sẽ bị vô hiệu hóa. Sự kết hợp ựặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể có thể xảy ra trong cơ thể (in vivo) hoặc trong ống nghiệm (in vitro).
Kháng thể dịch thể ựặc hiệu là chất hòa tan do các cơ quan và tế bào có thẩm quyền miễn dịch sản xuất ra sau khi bị kháng nguyên kắch thắch và tồn tại trong dịch thể của cơ thể như trong sữa, trong các chất tiết và trong các chất dịch. Chủ yếu là có trong huyết thanh, do vậy trong huyết thanh chứa kháng thể ựặc hiệu ựược gọi là kháng huyết thanh.
Trong huyết thanh có nhiều thành phần ựó là α, β, γ globulin và albumin, trong ựó kháng thể chủ yếu là γ globulin, vì vậy người ta gọi kháng thể là globulin miễn dịch hay immunoglobulin, ký hiệu là Ig.
5.1.2. đặc tắnh
Kháng thể dịch thể ựặc hiệu là những chất có bản chất là protein, có phân tử lượng lớn từ 160.000 - 1.000.000 Dalton.
Có tắnh ựặc hiệu với kháng nguyên rất cao, mỗi loại kháng thể chỉ kết hợp ựặc hiệu duy nhất với loại kháng nguyên kắch thắch sinh ra chúng, vắ dụ: kháng thể chống ựộc tố uốn ván chỉ kết hợp với ựộc tố uốn ván, không kết hợp ựược với ựộc tố bạch hầu.
Kháng thể dịch thể tồn tại một thời gian trong huyết thanh và chất dịch của cơ thể, dài hay ngắn, phụ thuộc vào yếu tố kắch thắch của kháng nguyên, phụ thuộc vào cơ thể vật chủ và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác.
Do kháng thể có bản chất là một protein, nên khi xâm nhập vào cơ thể khác loài, nó có khả năng kắch thắch cơ thể sinh kháng thể chống lại nó, người ta gọi ựó là tắnh kháng nguyên của kháng thể và huyết thanh chứa kháng thể này ựược gọi là kháng kháng thể.
Phần ựặc hiệu có khả năng liên kết với kháng nguyên ựược gọi là Ộtrung tâm hoạt ựộngỢ của kháng thể. Kháng thể có bao nhiêu Ộtrung tâm hoạt ựộngỢ thì có bấy nhiêu hóa trị, thông thường có hai hóa trị như phân tử IgG, nhưng cũng có thể kháng thể có ựa hóa trị.
Kháng thể dịch thể có bản chất là protein, nên kháng thể dễ bị cồn, nhiệt ựộ, hóa chất, axit, kiềm, các loại men phá hủy.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ44
Hiện nay ựã biết có 5 loại kháng thể dịch thể ựặc hiệu hay còn gọi là các lớp globulin miễn dịch, ựó là: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Các lớp globulin miễn dịch này có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng thể nói chung là như nhau, chúng chỉ khác nhau ở cấu trúc chuỗi nặng.
Immunoglobulin miễn dịch (Ig) là thành phần kháng thể (antibody) ựặc biệt của một cơ thể ựược sản xuất khi chịu tác ựộng của một số tác nhân nhất ựịnh, trong những ựiều kiện nhất ựịnh, tham gia quá trình ựáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân có hại. Kháng thể ở ựộng vật thủy sản không ựa dạng như kháng thể của các loài ựộng vật có vú và chim. Khả năng liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể, tuy cũng là mối liên kết ựặc hiệu giữa
epitope kháng nguyên với vị trắ liên kết kháng nguyên của kháng thể, nhưng mức ựộ và ái tắnh liên kết không ựược mạnh mẽ như ở ựộng vật có vú và chim.
a. Lớp IgG
Chiếm khoảng 75 - 85% tổng số miễn dịch của cơ thể, phần lớn kháng thể lưu ựộng thuộc lớp IgG. Hoạt tắnh của IgG rất cao so với các lớp Ig khác. IgG có phân tử lượng 160.000 Dalton, hằng số lắng là 7S, là kháng thể có hai hóa trị, tức là có khả năng kết hợp ựược với hai phần tử kháng nguyên tương ứng Ờ IgG có cấu trúc gồm 2 chuỗi nhẹ lamda (λ) hoặc kappa (K) và hai chuỗi nặng gamma (γ).
IgG xuất hiện chậm hơn IgM, thường sau 6 - 7 ngày, nên gọi là kháng thể muộn, nhưng tồn tại lâu trong huyết thanh và có vai trò to lớn trong miễn dịch.
IgG là kháng thể có lợi cho cơ thể, nhưng cũng có lúc IgG gây tai biến trầm trọng, như các trường hợp bệnh huyết thanh cấp tắnh và mãn tắnh.
IgG có 4 lớp phụ là IgG1, IgG2, IgG3 và IgG4, các lớp phụ này có hoạt tắnh sinh học khác nhau chút ắt.
Hình 5-1. Cấu trúc phân tử IgG và IgM
b. Lớp IgM
Kháng thể ở ựộng vật thủy sản, hay còn gọi là kháng thể teleost Ig, chỉ tập trung chủ yếu vào một loại duy nhất có vai trò trong ựáp ứng miễn dịch, ựó là IgM-4 phân tử
(tetrameric IgM) (Hình 5-1). Cá là loại ựộng vật ựầu tiên trong hệ thống loài tiến hoá, bắt
chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H Liên kết tứ phân (4 phân tử) IgM-4 phân tử (tetrameric IgM) chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H chuỗi nhẹ L chuỗi nặng H Liên kết tứ phân (4 phân tử) IgM-4 phân tử (tetrameric IgM) Chuỗi nặng H Chuỗi nhẹ L Chuỗi nhẹ L Cầu nối S-S
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ45
ựầu sử dụng kháng thể trong ựáp ứng miễn dịch, do vậy, sự bảo tồn kháng thể không phân lớp phản ánh quá trình tiến hóa hệ miễn dịch ở chúng. Trên cá, bắt ựầu từ bò sát, chim, thú, ựộng vật bậc cao hệ miễn dịch ựa dạng hơn, tiến hóa phong phú hơn, thể hiện ở chỗ có nhiều loại immunoglobulin miễn dịch (Ig) và trong mỗi loại kháng thể ựã có thêm nhiều phân lớp (class) và phân type (isotype) hơn tham gia ựáp ứng miễn dịch.
IgM chiếm khoảng 5 - 10% globulin miễn dịch của cơ thể, là globulin miễn dịch lớn nhất, có phân tử lượng từ 800.000 - 1.000.000 Dalton, hằng số lắng là 19S. Một phân tử nền của kháng thể IgM-4 phân tử có cấu trúc bao gồm 4 chuỗi polypeptide liên kết với nhau qua cầu nối disulfide (-S-S-), mỗi chuỗi polipeptide gồm 2 chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa và 2 chuỗi nặng muy nên ựược ký hiệu k2ộ2 hoặc λ2ộ2.
Ở ựộng vật bậc cao, 5 phân tử IgM cụm lại với nhau thành ngôi sao 5 cánh nhờ cầu nối disunphua và chuỗi peptid nhỏ nên IgM có tới 10 vị trắ kết hợp kháng nguyên vì thế hoạt tắnh của IgM mạnh hơn hoạt tắnh của IgG gấp từ 60-180 lần. Tuy nhiên, thời gian tồn tại của IgM rất ngắn, chỉ vài ba ngày, ựây là loại kháng thể xuất hiện sớm nhất, sau 1 - 2 ngày IgM ựã có trong huyết thanh, nên còn gọi là kháng thể sớm, sau ựó IgG xuất hiện thay thế IgM.
IgM cũng ựáp ứng với polysaccaloid, vỏ nhầy của nhiều loại vi khuẩn nên ựược dùng ựể chống lại các loại vi khuẩn này. Ở cá IgM hoạt ựộng mạnh hơn.
c. Lớp IgA
Có 2 lớp: IgA trong huyết thanh và IgA tiết tại chỗ
- IgA trong huyết thanh: có phân tử lượng 150.000, hằng số lắng là 7S, cấu trúc gồm 2 chuỗi nhẹ lamda (λ) hoặc kappa (K) và hai chuỗi nặng anpha (α).
- IgA tiết tại chỗ: có trong nước bọt, nước mắt, trong các dịch tiết ở lỗ mũi, ở phế quản, ở ruột, ngoài ra còn có trong nước tiểu và sữa. IgA tiết tại chỗ là sản phẩm của các tế bào plasma có trong niêm mạc của các cơ quan nói trên tiết ra, do vậy gọi là IgA tiết tại chỗ.
Hình 5-2. Cấu trúc phân tử IgA
Về cấu trúc IgA trong huyết thanh gồm hai phân tử (dưới dạng dimer) ựược nối với nhau bằng một cầu nối với hai thành phần: chuỗi phụ J và mảnh tiết SP (secretory piece), cầu nối có phân tử lượng là 71.000 Dalton, còn IgA tiết có phân tử lượng 390.000 Dalton, hằng số lắng là 11S. Chuỗi J ựược xem như cầu nối bên trong hai phần Fc với nhau còn mảnh tiết SP cuộn và bao quanh bên ngoài trục Fc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ46
Chiếm hàm lượng rất thấp trong huyết thanh miễn dịch (dưới 0,3%) là loại dễ bị biến chất, chịu ựược nhiệt, bị thủy phân bởi enzym và bị các môi trường axit, kiềm phá huỷ. Có phân tử lượng 170.000 - 200.000 Dalton, hằng số lắng là 7S, gồm hai chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa, và hai chuỗi nặng delta (δ). IgD tăng trong các trường hợp nhiễm khuẩn mãn tắnh, nhưng không ựặc hiệu cho loài nào, IgD có trong kháng thể kháng tuyến giáp trạng, kháng insulin, kháng penicilline, IgD không kết hợp với bổ thể, không gây phản vệ trên da chuột lang. Chức năng sinh học của IgD còn ựược biết rất ắt, có lẽ IgD có vai trò như thụ thể cho kháng nguyên vì nó gắn trên bề mặt lympho B ựể tạo ựiểm thụ thể giữa lympho B với kháng nguyên tương ứng.
e. Lớp IgE
Chiếm tỷ lệ rất thấp, gồm hai chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa và hai chuỗi nặng epsilon (ε), trọng lượng phân tử là 180.000 Dalton, hằng số lắng là 8S. IgE bị diệt ở nhiệt ựộ 56ồC 30 phút, IgE là loại kháng thể thường gây nên các hiện tượng miễn dịch bệnh lý, nó thường bám lên bề mặt tế bào, khi có kháng nguyên, kháng nguyên sẽ liên kết chúng lại và tác ựộng làm cho tế bào giải phóng các axit amin hoạt ựộng mạnh gây ựộc cho tế