Immunosorbent Assay).
đây là kỹ thuật khá nhạy và ựơn giản, cho phép xác ựịnh kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng ựộ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml).
So với kỹ thuật miễn dịch phóng xạ thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn ựảm bảo ựộ chắnh xác như nhau.
Kỹ thuật này giống kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng khác ở chỗ thay vì gắn kháng thể với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một enzyme.
Khi cho thêm cơ chất thắch hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu.
Sự xuất hiện màu chứng tỏ ựã xảy ra phản ứng ựặc hiệu kháng thể với kháng nguyên, và thông qua cường ựộ màu mà biết ựược nồng ựộ kháng nguyên cần phát hiện.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ70
Kỹ thuật ELISA ựược dùng nhiều là kỹ thuật trực tiếp và gián tiếp. Các enzyme thường dùng là βgalactoxidase, glucooxidase, peroxidase, và phophataza kiềm.
đây là một trong những phương pháp quan trọng ựược ứng dụng rộng rãi trong miễn dịch học thú y và miễn dịch học thủy sản.
a. Phản ứng ELISA gián tiếp tìm kháng thể
Nguyên lý: Các giếng của khay nhựa ựược phủ sẵn kháng nguyên. Kháng nguyên phải ựược gắn chặt vào khay nhựa sao cho sau khi rửa phải còn một lớp kháng nguyên phủ trong các giếng. Nhỏ huyết thanh (cần kiểm tra) vào các giếng, nếu trong huyết thanh có kháng thể ựặc hiệu thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên ựược pha sẵn trong giếng.
Hình 6-7. ELISA gián tiếp (Ian R. Tizard. 2004)
(Kháng nguyên ựược gắn trực tiếp vào khay. Sự có mặt của kháng thể sẽ ựược xác ựịnh bằng kháng kháng thể ựã gắn enzyme. Sau khi thêm cơ chất phản ứng màu sẽ xuất hiện tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong huyết thanh.)
Sau khi ủ và rửa ựể loại bỏ kháng thể không gắn với kháng nguyên, kháng thể ựã kết hợp với kháng nguyên ựược phát hiện bởi kháng kháng thể ựã ựược gắn enzyme, nhỏ cơ chất của enzyme làm ựổi màu thành phần phản ứng. độ ựậm của màu sắc tỷ lệ với lượng kháng kháng thể gắn enzyme ựược gắn với kháng thể có trong giếng, tức là tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong huyết thanh. Kết quả của phản ứng ựược xác ựịnh bằng mắt thường hoặc bằng máy ựo quang phổ.
b. Phản ứng ELISA trực tiếp tìm kháng nguyên
Cố ựịnh kháng thể ựặc hiệu vào các giếng của khay nhựa, rửa nước ựể loại bỏ kháng thể không gắn.
Cho huyết thanh hoặc huyễn dịch bệnh phẩm (nghi có chứa kháng nguyên) ựã chiết xuất thành dung dịch vào. Nếu có kháng nguyên tương ứng chúng sẽ gắn với kháng thể ựặc hiệu. Rửa nước ựể loại bỏ các thành phần thừa.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ71
Cho kháng kháng thể ựã gắn enzym vào. Kháng kháng thể sẽ gắn với kháng nguyên trong phức hợp kháng nguyên - kháng thể ở bước trên. Rửa nước ựể loại bỏ các thành phần thừa của phản ứng.
Sau khi cho cơ chất của enzym vào, nếu có xuất hiện màu tức là có kháng nguyên tương ứng với kháng thể ựặc hiệu, phản ứng dương tắnh.
Hình 6-8. ELISA sandwich (Ian R. Tizard. 2004)
(Kháng thể ựược gắn vào khay nhựa. Sự có mặt của kháng nguyên ựược xác ựịnh bằng kháng thể thứ 2 và kháng - kháng thể ựã gắn enzyme)
Nếu không xuất hiện màu, tức là không có kháng nguyên tương ứng với kháng thể nên không có kết hợp kháng nguyên - kháng thể và kháng nguyên và kháng kháng thể bị rửa trôi. Phản ứng âm tắnh.
Phản ứng này tạo ra tập hợp kháng thể - kháng nguyên - kháng thể nên còn ựược gọi là phản ứng ELISA sandwich. Phản ứng này ựược sử dụng rộng rãi, ựặc biệt trong trường hợp lượng kháng nguyên quá ắt không ựủ ựể phát hiện bằng phương pháp trực tiếp.