5.3.1. Khái niệm di truyền học khu hệ gen immunoglobulin
Hệ gen của người bao gồm khoảng 30 nghìn gen ựang hoạt ựộng. Tổng số thụ thể (receptor) tiếp xúc với kháng nguyên của mỗi một loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch chắnh (lympho B và lympho T) ước chừng khoảng 2,5x107. Như vậy, với một số lượng gen ựang hoạt ựộng ắt như vậy, lại chịu trách nhiệm sản xuất nhiều loại protein quan trọng khác của cơ thể, làm sao mà cơ thể có thể có ựến hàng chục triệu thụ thể trên bề mặt tế bào cho mỗi loại lympho B và lympho T. Câu trả lời ựơn giản là sự ựa dạng thụ thể của chúng chắnh là kết quả của quá trình sắp xếp lại các phân ựoạn gen hay còn gọi là quá trình tái tổ hợp, ựể tạo nên các gen hoàn chỉnh sản xuất kháng thể tương ứng, sau khi tiếp nhận kắch thắch của kháng nguyên.
Như chúng ta biết, cấu trúc kháng thể dịch thể bao gồm chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L mà ở mỗi chuỗi ựều có vùng biến ựổi V và vùng hằng ựịnh C. Hai chuỗi nặng H và L liên kết với nhau tạo nên cấu trúc khung của kháng thể.
Có 4 vùng gen mà mỗi một vùng chứa rất nhiều phân ựoạn gen Ộtiền bốiỢ hay còn gọi là gen nguồn (germ-line genes), tạo cơ sở cho sự tái tổ hợp thành công gen hoàn chỉnh ựể tổng hợp chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L.
Các vùng gen ựó là:
- Vùng gen biến ựổi, gọi là vùng V (variable); - Vùng gen hằng ựịnh, gọi là vùng C (constant); - Vùng gen nối, gọi là vùng J (joining);
- Vùng gen ựa dạng, gọi là vùng D (diversity) (chỉ cho chuỗi nặng H).
Mỗi một vùng biến ựổi trong chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L ựều có 3 phân vùng Ộsiêu biến ựổiỢ.
- đối với chuỗi nhẹ L, cả 3 phân vùng Ộsiêu biến ựổiỢ ựều do sự tái tổ hợp các gen của vùng V mã hoá ựể tổng hợp.
- đối với chuỗi nặng H, hai phân vùng Ộsiêu biến ựổiỢ do sự tái tổ hợp các gen của vùng V, còn phân vùng Ộsiêu biến ựổiỢ thứ 3 một phần do các gen vùng V, một phần do sự tái tổ hợp các gen của một vùng khác gọi là vùng D, mã hoá ựể tổng hợp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ56
Tuỳ theo chuỗi nặng hay chuỗi nhẹ, mà mỗi vùng gen trong khu hệ gen chịu tách nhiệm sản xuất immunoglobulin nói trên lại có các phân vùng gen riêng biệt, ký hiệu là: VH, DH, JH, CH và VL (Vk, Jk, Vl, Jl).
Quá trình tái tổ hợp các phân ựoạn gen mà thực chất là sắp xếp V(D)J của chuỗi nặng H xảy ra trên nhiễm sắc thể số 14; sắp xếp VJ của chuỗi nhẹ L xảy ra trên nhiễm sắc thể số 2 (chuỗi kappa) và số 22 (chuỗi lamda).
Hình 5-5. Cấu trúc phân tử của kháng thể 5.3.2. Cơ chế phân tử sản xuất kháng thể của tế bào lympho B
a. Tái tổ hợp hình thành gen sản xuất chuỗi nặng H của kháng thể
Có 4 vùng gen thực hiện Ộtái tổ hợpỢ hay còn gọi là sự Ổsắp xếp lạiỢ các phân ựoạn gen trong quá trình hình thành gen hoàn chỉnh ựể sản xuất chuỗi nặng H của kháng thể, ựó là: vùng VH, DH, JH và CH, tất cả các vùng gen này ựều nằm trên nhiễm sắc thể số 14.
để tạo nên các gen hoàn chỉnh tổng hợp chuỗi nặng H của kháng thể dịch thể, cơ thể sử dụng:
51 phân ựoạn VH (V = ỘvariableỢ). Mỗi một phân ựoạn mã hoá cho các axit amin ở ựầu tận cùng N, bao gồm cả 2 khu vực Ộsiêu biến ựổiỢ trong 3 khu vực Ộsiêu biến ựổiỢ của chuỗi nặng H.
25 phân ựoạn DH (D ="diversity"). Các phân ựoạn này mã hoá cho khu vực Ộsiêu biến ựổiỢ thứ 3 trong chuỗi nặng H.
6 phân ựoạn JH (J = "joining"). Các phân ựoạn này mã hoá cho các axit amin của phần còn lại của vùng biến ựổi V và một phần axit amin của khu vực Ộsiêu biến ựổiỢ thứ 3 trong chuỗi nặng H.
9 phân ựoạn CH. Các phân ựoạn này mã hoá cho các axit amin của vùng hằng ựịnh của chuỗi nặng H. Các phân ựoạn này mã hoá cho các axit amin của vùng hằng ựịnh C của chuỗi nặng H.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ57
9 phân ựoạn ựó là: 1 mu (m), mã hoá cho vùng C của IgM; 1 delta (δ) cho IgD, 4 gamma (γ) cho vùng C của 4 lớp phụ của IgG, 1 epsilon (ε) cho IgE và 2 alpha (α) cho vùng hằng ựịnh C của 2 loại IgA.
Trong quá trình biệt hoá của tế bào B và trước khi tiếp xúc với kháng nguyên, các phân ựoạn ADN (phân ựoạn gen) trong các vùng này cũng ựã tiến hành sắp xếp (tái tổ hợp) ựể hình thành nên gen nguồn cho chuỗi nặng H. Gen này có thể ựược sao chép sang ARN thông tin sơ cấp ựể rồi chuẩn bị phiên mã tổng hợp nên chuỗi nặng H.
Hình 5-6. Cơ chế phân tử tái tổ hợp gen tổng hợp chuỗi nặng H
b. Cơ chế hợp nhất các phân ựoạn V(D)J tạo nên gen sản xuất chuỗi nặng H
Mỗi một vùng V, D, J, ở một ựầu hoặc ở cả 2 ựầu cuối của chúng, ựều chứa một cấu trúc ADN ngắn gọi là Ộchuỗi tắn hiệu tái tổ hợpỢ, ký hiệu là RSS (recombination signal sequence).
RSS nằm ở ựầu cuối 3' của mỗi một phân ựoạn gen vùng V; ở cả 2 ựầu cuối của mỗi một phân ựoạn gen vùng D và ở ựầu cuối 3Ỗ của mỗi một phân ựoạn gen vùng J.
Các RSS ựược nhận biết bởi 2 loại protein có chức năng hoạt hoá tái tổ hợp, ựó là protein RAG-1 và RAG-2, do 2 gen RAG-1 và RAG-2 (recombination activating genes) tổng hợp.
Hai loại protein RAG-1 và RAG-2 cắt các phân ựoạn gen của các vùng V, D, J tại các ựiểm nhận biết của RSS, ựể tạo nên các phân ựoạn gen lưu ựộng có tên gọi là DSB (double stranded breaks).
Sau ựó, các phân ựoạn gen lưu ựộng DSB chuyển dịch và nối lại với nhau ựể tạo nên hợp gen mã hoá (coding joint) và hợp gen tắn hiệu (signal joint).
Hợp gen mã hoá bao gồm D-J hoặc V-DJ mã hoá cho chuỗi nặng H; V-J mã hoá cho chuỗi nhẹ L. Hợp gen tắn hiệu là một vòm (loop) hình thành sau khi toàn bộ những phần gen không cần thiết ựã bị xoá.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ58
Hợp nhất D-J xảy ra trước, sau ựó mới bổ sung thêm V tạo nên hợp gen mã hoá V-DJ. Hợp nhất của 51 VH, 25 DH và 6 JH cho một số lượng biến thể tái tổ hợp thấp nhất vào khoảng 7.65 x 103, nhưng trong thực tế ựa dạng của vùng V cao hơn nhiều lần như vậy. điều này ựược giải thắch là các phân ựoạn gen lưu ựộng DSB khi nối lại với nhau giữa VH và DH cũng như giữa DH và JH có sự xê dịch một vài nucleotit tạo nên sự ựa dạng.
c. Hợp nhất các phân ựoạn V-J tạo nên gen sản xuất chuỗi nhẹ L
Sau khi gen hoàn chỉnh của chuỗi nặng H ựã ựược tái tổ hợp, sao chép và dịch mã tổng hợp polypeptit của chuỗi nặng, lúc ựó, các phân ựoạn gen của chuỗi nhẹ L cũng bắt ựầu quá trình tái tổ hợp và tạo nên gen hoàn chỉnh của chuỗi nhẹ.
Hình 5-7. Cơ chế phân tử tái tổ hợp gen tổng hợp chuỗi nhẹ L
Quá trình tái tổ hợp gen chuỗi nhẹ L cũng theo qui trình như của chuỗi nặng H, thực hiện trên nhiễm sắc thể số 2 (chuỗi kappa) và trên nhiễm sắc thể số 22 (chuỗi lamda). Cụ thể, có 40 phân ựoạn gen Vk, 5 phân ựoạn gen Jk tham gia tạo nên 200 chuỗi kappa; 31 phân ựoạn gen Vl, 4 phân ựoạn gen Jl tham gia tạo nên 124 chuỗi lamda.
Như vậy, có ắt nhất 2,5 triệu tế bào nguồn lympho B ựã ựược tạo ra trong ựó ựã có sự chuyển ựổi các vùng gen ựể tái tổ hợp ựể tạo nên gen sản xuất kháng thể dịch thể ựặc hiệu có các vùng biến ựổi khác nhau tương ứng với kháng nguyên kắch thắch.
Trong thực tế số lượng dòng tế bào B là không hạn chế do có nhiều khả năng tái tổ hợp hơn và có sự xê dịch một vài nucleotit trong quá trình tái tổ hợp, tạo nên nhiều sự ựa dạng hơn về sắp xếp gen kháng thể.
Trong quá trình tái tổ hợp VDJ (chuỗi nặng) và VJ (chuỗi nhẹ), sự ựa dạng kháng thể còn là kết quả của sự xê dịch một vài nucleotit ở ựầu cuối của mỗi phân ựoạn gen. Sự thêm vào 3-6 nucleotit mã hoá cho 1-2 axit amin dễ dàng ựược chấp nhận bổ sung vào phân vùng biến ựổi của kháng thể, vì chúng không làm thay ựổi khung ựọc (dịch mã) của gen kháng thể trong quá trình sao chép và tổng hợp axit amin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ59
Tuy nhiên, nếu ựược thêm vào chỉ có 1 hay 2 hoặc 4 hay 5 nucleotit, thì sự xê dịch này sẽ làm cho khung ựọc của gen không sao chép ựược hoặc bị thay ựổi thành phần và do vậy, rất có thể không có sự tổng hợp kháng thể hoặc polypeptit ựược sinh ra không phải là protein kháng thể.
Mặc dù vậy, cơ thể vẫn tìm cách sản xuất ựược kháng thể theo kắch thắch nguyên thuỷ của kháng nguyên, do cơ thể có khả năng thay thế hoạt hoá tái tổ hợp, cụ thể:
Bảng 5-1. Khả năng tái tổ hợp hình thành các gen hoàn chỉnh sản xuất kháng thể dịch thể khi có kháng nguyên kắch thắch
Vùng gen của kháng thể dịch thể
Số lượng
phân ựoạn gen Sản phẩm tái tổ hợp
Vκ 40 Jκ 5 200 chuỗi κ (kappa) Vλ 31 Jλ 4 124 chuỗi λ (lamda) VH 51 DH 25 JH 6 7.650 chuỗi H
Bất kỳ chuỗi H với bất kỳ chuỗi L
(324 khả năng) 2.5 x 10
6
Trên ựơn vị nhiễm sắc thể chức năng ựược chỉ ựịnh trước trong tế bào B, tuy ựã tạo ựược tái tổ hợp có gen sản xuất kháng thể, nhưng không sản xuất ựúng sản phẩm, cơ thể sẽ hoạt hoá các phân ựoạn gen có trên nhiễm sắc thể ựối diện (do nhiễm sắc thể tồn tại từng cặp ựối xứng), ựể tiến hành lại quá trình tái tổ hợp. Người ta gọi ựây là khả năng thay thế nhiễm sắc thể chức năng.
Nếu cả hai không hoàn thành tái tổ hợp cho việc sản xuất chuỗi kappa, trên nhiễm sắc thể số 2; cơ thể vẫn còn 2 cơ hội khác ựể hoạt hoá và tái tổ hợp gen sản xuất chuỗi lamda trên nhiễm sắc thể số 22. đây là khả năng thay thế tái tổ hợp chuỗi gen.
Như vậy, cơ thể ựã chuẩn bị cho tế bào lympho B một số khả năng có thể ựể hoàn thành chức năng tạo nên gen hoàn chỉnh sản xuất ựúng kháng thể cần thiết, ựó là ựảm bảo việc tái tổ hợp thành công gen sản xuất chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda trên nhiễm sắc thể số 2 và 22.
5.3.3. Tái tổ hợp tạo lớp/nhóm kháng thể khác nhau
Sau khi hoàn thành quá trình tái tổ hợp cho một loại kháng thể thuộc một lớp nhất ựịnh (vắ dụ: IgG), tế bào B còn có khả năng linh hoạt cắt rời phần gen ựặc hiệu trong hợp gen VDJ của lớp kháng thể này, ựể chuyển dịch lắp vào phần tái tổ hợp hằng ựịnh của lớp kháng thể khác, ựể tạo nên hợp gen VDJ mới, tương ứng với nhóm/lớp kháng thể khác nhau, mà vẫn giữ nguyên tắnh ựặc hiệu của kháng thể.
đây là khả năng ựa dạng hoá kháng thể ựối phó với một loại kháng nguyên kắch thắch. Người ta gọi quá trình này là khả năng tái tổ hợp tạo lớp/nhóm kháng thể khác nhau, ký hiệu là CSR (class switch recombination).
Do có khả năng này nên tế bào B sản xuất ựược 4 lớp phụ của kháng thể IgG (IgG1; IgG2; IgG3; IgG4), 2 loại kháng thể IgA: IgA huyết thanh và IgA tiết tại chỗ, hoặc cùng lúc sản xuất IgM, IgG thậm chắ IgA và các kháng thể khác, cho cùng một loại kháng nguyên kắch thắch.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ60
Thực chất của quá trình này là sự ựiều ựộng phần chuỗi gen nằm ở ựầu 3Ỗ của vùng biến ựổi V (bao gồm chuỗi gen VH và VL) và một phần hằng ựịnh (cụ thể: CH1 và CL) ựể lắp vào ựầu 5Ỗ của vùng gen CH (cụ thể: CH2, CH3) của hợp gen kháng thể loại khác. Kháng thể lớp/nhóm mới chỉ khác nhau ở phần hằng ựịnh, mà không khác nhau ở phần biến ựổi, do ựầu NH2 của chuỗi nặng H và toàn bộ chuỗi nhẹ L vẫn còn nguyên vẹn, do vậy, vẫn ựảm bảo chức năng ựặc hiệu với loại kháng nguyên tương ứng.
Khả năng tái tổ hợp tạo lớp/nhóm kháng thể khác nhau giúp cơ thể nhanh chóng và linh hoạt sản xuất kháng thể theo nhiều kiểu loại khác nhau ựể ựối phó với một loại kháng nguyên kắch thắch.
Vắ dụ: trong trường hợp kháng nguyên có nguồn gốc là các loại vi khuẩn hay virus ựường ruột và ựường hô hấp, trong cơ thể có kháng thể dịch thể (IgM; IgG) tham gia miễn dịch dịch thể và kháng thể tiết tại chỗ của IgA tham gia miễn dịch niêm mạc.
Câu hỏi ôn tập:
1. Thế nào là kháng thể ựặc hiệu? đặc tắnh của kháng thể ựặc hiệu? Trình bày tóm tắt cấu trúc và chức năng của các loại kháng thể dịch thể ựặc hiệu trong ựáp ứng miễn dịch dịch thể?
2. Cho biết quy luật hình thành kháng thể ựặc hiệu? Ảnh hưởng của kháng nguyên ựến sự hình thành kháng thể ựặc hiệu ựược thể hiện như thế nào?
3. Trình bày các giả thuyết giải thắch cơ chế hình thành kháng thể ựặc hiệu? Ưu và nhược ựiểm của các giả thuyết này?
4. Kháng thể ựơn dòng là gì? Nguyên tắc của phương pháp sản xuất kháng thể ựơn dòng ngoài cơ thể như thế nào? Cho biết ưu ựiểm và lợi ắch của phương pháp này?
5. Trình bày cơ chế phân tử của sự tái tổ hợp gen tổng hợp chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L của kháng thể?
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Giáo trình Miễn dịch học Thuỷ sản ẦẦẦẦẦẦẦẦ61
Chương 6
PHẢN ỨNG KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ
Nhiều phản ứng miễn dịch phụ thuộc vào phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể phản ứng ựặc hiệu với kháng nguyên kắch thắch sinh ra nó. Kháng thể không nhìn thấy ựược bằng mắt thường nên chỉ có thể xác ựịnh chúng khi chúng gắn với kháng nguyên ựặc hiệu. Sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể dịch thể ựặc hiệu xảy ra nhờ các lực liên kết lý hóa sau:
Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals.
Lực hút tĩnh ựiện giữa các nhóm chức khác nhau. Vắ dụ giữa nhóm amin và nhóm carboxyl.
Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau Lực kỵ nước
Phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể có thể ựược xác ựịnh thông qua sự kết tủa, ngưng kết, cố ựịnh bổ thể, sự phát huỳnh quang, hoạt tắnh enzym và gắn với chất ựồng vị phóng xạ. Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng thể.
6.1. PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT 6.1.1. Nguyên lý
đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (vắ dụ như xác vi khuẩn). Khi gặp kháng thể ựặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành ựám lớn mà mắt thường có thể quan sát ựược. đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp.
Khi cơ thể ựược miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể ựặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể ựặc hiệu tương ứng, thì các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể ựặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những ựám ngưng kết biểu hiện bằng những ựám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng.
Các phản ứng ngưng kết thường ựơn giản, dễ làm, có ựộ nhạy cao, không tốn kém, ựược sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược ựiểm là khó ựạt trình ựộ chắnh xác cao, thường hay cho phản ứng dương tắnh giả.
6.1.2. Các loại phản ứng ngưng kết
a. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh
Là phản ứng có tắnh chất ựịnh tắnh, thường sử dụng kháng nguyên ựã biết và nhuộm màu ựể phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh.