in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin.
Cụm chồi của cây sâm Việt Nam in vitro bắt đầu tăng sinh chồi mới vào ngày nuôi cấy thứ 14 ở một số nghiệm thức. Các chồi bắt đầu tăng nhanh số lượng từ ngày nuôi cấy 21 ở tất cả nghiệm thức (Hình 3.22). Sau 28 ngày nuôi cấy, số chồi hình thành lớn nhất (3 chồi/mẫu) ở nghiệm thức MB (khoáng MS và vitamin Gamborg B5). Đến ngày thứ 35, sự gia tăng chồi khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức và lớn nhất (6,42 chồi/mẫu) ở nghiệm thức MB (Hình 3.22).
• Gia tăng số chồi
Gia tăng số chồi ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 42 đều khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.6). Số chồi hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro giảm khi nồng độ khoáng đa lượng giảm còn 2/3 hay 1/2. Khi môi trường nuôi cấy được bổ sung vitamin Gamborg B5 (Gamborg và cs., 1968), mẫu cấy có sự gia tăng số chồi lớn hơn so với khi nuôi trên cùng môi trường khoáng MS hay MS2/3 nhưng bổ sung vitamin Morel. Ở nghiệm thức MB (khoáng đa lượng MS giữ nguyên và vitamin Gamborg B5), số chồi gia tăng lớn nhất với 9,58 chồi/mẫu, hơn 2 lần so với nghiệm thức MM (khoáng đa lượng MS, vitamin Morel) chỉ gia tăng thêm có 4,75 chồi/mẫu vào ngày nuôi cấy thứ 42. Đối với môi
trường khoáng đa lượng MS giảm 1/2, không có sự khác biệt về số lượng chồi gia tăng khi thay vitamin Morel bằng vitamin Gamborg B5. Tuy nhiên, khi khoáng đa lượng MS trong môi trường nuôi cấy giảm còn 2/3, vitamin Gamborg B5 đã tạo nên sự khác biệt rõ rệt (gia tăng chồi nhiều hơn), cùng xu hướng như khi khoáng đa lượng MS trong môi trường nuôi cấy được giữ nguyên (Hình 3.24).
Hình 3.22.Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy của cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau.
(M bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng MS, M bên phải tượng trưng cho vitamin Morel, B tượng trưng cho vitamin Gamborg B5, 1/2 và 2/3 tượng trưng cho nồng độ khoáng đa lượng MS).
• Chiều cao chồi
Chiều cao chồi giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 3.6). Tuy nhiên, nếu xem xét kết quả của cùng một loại vitamin thì việc giảm hàm lượng các chất khoáng có ảnh hưởng phần nào đến chiều cao chồi (Bảng 3.6).
• Trọng lượng tươi mẫu
Trọng lượng tươi của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 3.6). Nghiệm thức MB
0 2 4 6 8 10 12 7 14 21 28 35 42 Gia tăn g số chồi/m ẫu Ngày MM MB 1/2MM 1/2MB 2/3MM 2/3MB
có gia tăng số chồi lớn nhất nên trọng lượng tươi của cụm chồi sau 42 ngày nuôi cấy cũng đạt được cao nhất (332,28 mg/mẫu). Trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy gia tăng khi vitamin Morel được thay thế bằng vitamin Gamborg B5 ở cùng một điều kiện khoáng đa lượng (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 42. Tên NTz Gia tăng số chồi
(chồi/mẫu)
Chiều cao chồi (mm) TLT mẫu (mg/mẫu) TLK mẫu (mg/mẫu) % chất khô MM 4,75 cx 20,00 211,81 b 23,78 11,22 2/3MM 5,07 c 13,00 204,20 b 22,08 10,81 1/2MM 7,27 b 19,33 234,09 b 25,72 10,99 MB 9,58 a 17,42 332,28 a 32,81 9,87 2/3MB 7,00 b 13,58 215,07 b 22,48 10,45 1/2MB 7,13 b 16,00 303,79 a 28,94 9,53 ANOVAy Khoáng (A) ** ns ** * ns Vitamin (B) ** ns ** * ** A x B ** ns ** ns ns CV (%) 4,94 21,98 6,21 11,76 6,17 Chú thích: z
M bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng MS giữ nguyên, M bên phải tượng trưng cho vitamin Morel, B tượng trưng cho vitamin Gamborg B5, 1/2 và 2/3 tượng trưng cho nồng độ khoáng đa lượng MS.
y ns, *, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05 hay p < 0,01.
x
các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
• Trọng lượng khô mẫu và phần trăm chất khô
Trọng lượng khô và phần trăm chất khô của cụm chồi ở ngày thứ 42 không có sự khác biệt về mặt thống kê khi kết hợp cả hai yếu tố khoáng đa lượng MS và vitamin (Bảng 3.6). Tuy nhiên, khi xét riêng từng yếu tố khoáng đa lượng hay vitamin thì sự khác biệt giữa các nghiệm thức đều ở mức p < 0,05 (Bảng 3.6). Trọng lượng khô và phần trăm chất khô của mẫu ở nghiệm thức MB vào ngày nuôi cấy thứ 42 vẫn lớn hơn so với các nghiệm thức khác dù không khác biệt về phương diện thống kê.
Hình 3.23. Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
(M bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng MS, M bên phải tượng trưng cho vitamin Morel, B tượng trưng cho vitamin Gamborg B5, 1/2 và 2/3 tượng trưng cho nồng độ khoáng đa lượng MS).
Các cụm chồi ở nghiệm thức 2/3MM (khoáng đa lượng MS2/3, vitamin Morel) có sự hình thành rễ trên mỗi mẫu cấy sớm nhất (ở ngày nuôi cấy thứ 14). Từ ngày thứ 21 trở đi, các cụm chồi bắt đầu hình thành rễ ở hầu hết các nghiệm thức. Các cụm chồi ở nghiệm thức 1/2MB (khoáng đa lượng MS1/2, vitamin Gamborg B5) có sự hình thành rễ tương đối chậm. Nghiệm thức 1/2MM (khoáng đa lượng
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 7 14 21 28 35 42 Số rễ/m ẫu Ngày MM MB 1/2MM 1/2MB 2/3MM 2/3MB
MS1/2, vitamin Morel) có sự hình thành rễ tăng nhanh từ ngày thứ 28 của quá trình nuôi cấy và đạt được 1,73 rễ/mẫu vào ngày thứ 35. Sau 42 ngày nuôi cấy, số rễ trung bình trên mỗi mẫu nuôi cấy cao nhất ở nghiệm thức 1/2MM (3,0 rễ/mẫu) và thấp nhất trong nghiệm thức 1/2MB (0,6 rễ/mẫu) (Hình 3.23). Sự hình thành rễ của cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường không có CĐHSTTV chịu tác động bởi các thành phần chất khoáng và loại vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Dube và cs. (2011) cũng nhận thấy khi Coleus forskohliiBriq. được nuôi cấy trên môi trường agar có khoáng MS nhưng không có CĐHSTTV đã hình thành rễ tốt với số rễ trung bình là 5,7 rễ/mẫu sau 20 ngày nuôi cấy. Sự hình thành rễ đạt hiệu quả cao trên môi trường không có auxin có thể do ảnh hưởng của hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy.
Hình 3.24. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin (thanh ngang = 5 mm). (M bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng MS, M bên phải tượng trưng cho vitamin Morel, B tượng trưng cho vitamin Gamborg B5, 1/2 và 2/3 tượng trưng cho nồng độ khoáng đa lượng MS).
Tùy theo đối tượng và mục đích nghiên cứu, việc nuôi cấy mô tế bào thực vật thành công đòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thích hợp khác nhau. Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy là một số chất vô cơ (nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng) và chất hữu cơ cơ bản. Ngoài ra, trong nuôi cấy mô truyền thống, môi trường nuôi cấy còn được bổ sung thêm nguồn cacbon và CĐHSTTV. Khoáng đa lượng và vi lượng là rất cần thiết cho sự tăng trưởng và biệt hóa của các mô tế bào thực vật được đưa vào nuôi cấy, vì khi đó chúng đã bị tách rời khỏi các nguồn cung cấp dinh dưỡng và năng lượng. Môi trường khoáng cơ bản phổ biến nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Môi trường này được biết đến là môi trường giàu đạm dưới dạng NH4NO3 (1650 mg l-1) và KNO3 (1900 mg l-1) (Phụ lục 1). Tuy nhiên, cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitrogia tăng số chồi thích hợp hơn trên môi trường nuôi cấy có hàm lượng khoáng đa lượng MS giữ nguyên. Điều này có lẽ do bản chất di truyền của thực vật là tạo rễ củ và sinh trưởng chậm nên khoáng đa lượng MS giữ nguyên hàm lượng sẽ giúp cụm chồi duy trì sự tăng trưởng tốt hơn.
Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng ít, không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Do đó, để duy trì sự tăng trưởng của mẫu trong nuôi cấy in vitro thì môi trường nuôi cấy cần được bổ sung thêm các vitamin. Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào. Chúng đều là coenzym hoặc tiền chất của các coenzym. Một số loại vitamin được sử dụng rộng rãi là inositol, vitamin B1 (thyamine-HCl), vitamin B3 (axit nicotinic), viatmin B5 (Ca – pantothenat) và vitamin B6 (pyridoxine-HCl). Trong đó, vitamin B1 được xem là loại vitamin thiết yếu đối với sự sinh trưởng và biến dưỡng của tế bào thực vật. Vitamin B1được tổng hợp trong lá hoặc chồi non (với ánh sáng là yếu tố thiết yếu). Sự phosphoryl hóa biến thyamine thành thyamine-pyrophosphat, chất này là cocacboxylase cần cho sự khử cacboxyl các axit cetonic. Trên thực tế, khi môi trường nuôi cấy có chứa inositol và vitamin B6
nhưng không có vitamin B1, tế bào huyền phù của ngô sau cấy chuyển một lần sẽ bị ngừng sinh trưởng, sau lần cấy chuyền thứ hai toàn bộ tế bào bị chết. Do đó,
vitamin B1 có vai trò quan trọng trong sự hình thành chồi bất định (Nguyễn Quang Thạch, 2009). Vitamin Gamborg B5 có khả năng làm tăng sinh chồi từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro tốt hơn so với vitamin Morel khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có khoáng đa lượng MS (Bảng 3.6). Điều này có thể do hàm lượng Thyamine (vitamin B1) trong thành phần vitamin Gamborg B5 cao gấp 10 lần so với vitamin Morel (Phụ lục 2).
Tóm lại, môi trường nuôi cấy cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro với thành phần khoáng đa lượng MS và vitamin Gamborg B5 đã giúp sự tăng trưởng và tạo chồi mới tốt nhất trong điều kiện thí nghiệm này.