phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.2.1. Mục tiêu
Khảo sát sự ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin khác nhau lên khả năng phát sinh phôi soma ở cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm
• Thí nghiệm 2a:Mẫu thí nghiệm là phiến lá.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm 2a. STT Tên NT Ngày 0 - 42 Ngày 43 - 70 Ngày 71 – 84 Auxin (mg l-1) Cytokinin (mg l-1) Auxin (mg l-1) Cytokinin (mg l-1) 1 PD 1 2,4-D 0 0,1 2,4-D 0 MS1/2 2 PDK 1 2,4-D 0,2 Kin 0,1 2,4-D 0,2 Kin 3 PDT 1 2,4-D 0,2 TDZ 0,1 2,4-D 0,2 TDZ 4 PDB 1 2,4-D 0,2 BA 0,1 2,4-D 0,2 BA 5 PN 2 NAA 0 0,1 NAA 0
6 PNK 2 NAA 0,2 Kin 0,1 NAA 0,2 Kin 7 PNT 2 NAA 0,2 TDZ 0,1 NAA 0,2 TDZ 8 PNB 2 NAA 0,2 BA 0,1 NAA 0,2 BA
9 PI 2 IBA 0 0,1 IBA 0
10 PIK 2 IBA 0,2 Kin 0,1 IBA 0,2 Kin 11 PIT 2 IBA 0,2 TDZ 0,1 IBA 0,2 TDZ 12 PIB 2 IBA 0,2 BA 0,1 IBA 0,2 BA
•Thí nghiệm 2b:Mẫu thí nghiệm là thân khí sinh.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 2b. STT Tên NT Ngày 0 - 42 Ngày 43 - 70 Ngày 71 – 84 Auxin (mg l-1) Cytokinin (mg l-1) Auxin (mg l-1) Cytokinin (mg l-1) 1 TD 1 2,4-D 0 0,1 2,4-D 0 MS1/2 2 TDK 1 2,4-D 0,2 Kin 0,1 2,4-D 0,2 Kin 3 TDT 1 2,4-D 0,2 TDZ 0,1 2,4-D 0,2 TDZ 4 TDB 1 2,4-D 0,2 BA 0,1 2,4-D 0,2 BA
5 TN 2 NAA 0 0,1 NAA 0 6 TNK 2 NAA 0,2 Kin 0,1 NAA 0,2 Kin 7 TNT 2 NAA 0,2 TDZ 0,1 NAA 0,2 TDZ 8 TNB 2 NAA 0,2 BA 0,1 NAA 0,2 BA
9 TI 2 IBA 0 0,1 IBA 0
10 TIK 2 IBA 0,2 Kin 0,1 IBA 0,2 Kin 11 TIT 2 IBA 0,2 TDZ 0,1 IBA 0,2 TDZ 12 TIB 2 IBA 0,2 BA 0,1 IBA 0,2 BA
2.2.2.3. Phương pháp thực hiện
- Mẫu cấy là 1 phiến lá hoặc 1 thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro. Phiến lá được cắt thành hình chữ nhật, ngang qua gân chính, chia thành 6 mảnh 5 x 2 mm (theo thứ tự từ ngọn đến cuống lá). Mặt dưới của phiến lá được đặt tiếp xúc với môi trường khảo sát (Hình 2.4, 2.5). Thân khí sinh được cắt ngang thành 4 đoạn dài 4 mm (vị trí 1 gần phiến lá, vị trí 4 ở gần gốc thân), cấy vào môi trường khảo sát (Hình 2.4, 2.5).
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố A là auxin với ba loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và yếu tố B là cytokinin với ba loại cytokinin (Kin, TDZ hay BA) (Bảng 2.3, 2.4). Ở mỗi loại vật liệu, thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 đĩa petri (φ = 8 cm), lặp lại 3 lần. Mỗi đĩa chứa 25 ml môi trường mang 1 thân khí sinh và 1 phiến lá. Tổng số đĩa của thí nghiệm là 144, tổng số mẫu của thí nghiệm là 144 mẫu phiến lá và 144 mẫu thân khí sinh. Đến ngày nuôi cấy thứ 71, chuyển tất cả các mẫu sang chai thủy tinh (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường không bổ sung CĐHSTTV. Chai được đặt nằm ngang và nuôi cấy trong cùng một điều kiện.
- Môi trường thí nghiệm gồm khoáng đa lượng MS1/2, khoáng vi lượng MS, vitamin Morel bổ sung 30 g l-1 đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa, 200 mg l-1
KNO3, 400 mg l-1 KH2PO4, 8 g l-1agar, pH được điều chỉnh trước khi hấp vô trùng là 5,8 ở 31oC. CĐHSTTV được bổ sung vào mỗi nghiệm thức theo Bảng 2.3, 2.4. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút.
-Thời gian thí nghiệm là 84 ngày (12 tuần).
Hình 2.4. Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam
in vitro (thanh ngang = 1 mm).
Hình 2.5. Cách bố trí mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh trên đĩa petri (thanh ngang = 1 mm).
2.2.2.4. Điều kiện thí nghiệm
-Cường độ ánh sáng : 20 + 5 µmol m-2 s-1. -Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
-Nhiệt độ : 24 oC trong giai đoạn chiếu sáng và 22oC trong giai đoạn tối. -Độ ẩm tương đối : 75 + 5 %.
-Buồng nuôi cấy : tủ điều khiển khí hậu Percival.
2.2.2.5. Chỉ tiêu theo dõi
-Thời gian xuất hiện phôi đầu tiên (ngày). -Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%).
-Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%). -Số lượng phôi/mẫu.
-Hình thái và giải phẫu phôi ở các giai đoạn phát triển.
2.2.3. Thí nghiệm 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi