môi trường nuôi cấy giúp tế bào tái lập tính hữu cực và đi vào giai đoạn biệt hóa thành phôi soma.
1.2.4.3. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh phôi soma soma
CĐHSTTV là những chất với liều lượng rất thấp gây ra phản ứng sinh học cao, có vai trò điều tiết các quá trình sinh lý, trao đổi chất của cơ thể thực vật. CĐHSTTV là nhân tố quan trọng hàng đầu trong việc xác định chiều hướng phát triển của mẫu cấy trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhất là cảm ứng sự phát sinh phôi soma. Hầu hết những mô thực vật in vitro để phát sinh phôi soma đều được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CĐHSTTV ở nồng độ nhất định. Các loại CĐHSTTV được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào bao gồm auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen.
• Auxin
Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh ngọn, mô phân sinh lóng và lá non, sau đó di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ. Auxin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng, phân hóa mô dẫn, phát triển chồi, phát sinh rễ (Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin là CĐHSTTV có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng sự hình thành và phát triển phôi soma (Komamine và cs., 1993; Yadav và Rajam, 1998). Trong số hơn 80% các nghiên cứu khoa học được công bố gần đây, việc cảm ứng quá trình sinh phôi soma đòi hỏi phải có sự hiện diện riêng của auxin hay kết hợp với cytokinin. Auxin được dùng nhiều nhất là 2,4-D (Hình 1.14). Các chất khác như NAA, IAA, IBA, picloram và dicamba cũng được sử dụng nhưng ở mức độ ít hơn (Bùi Trang Việt, 2000). Auxin có những ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn hình thành và phát triển phôi soma. Sự hiện diện của auxin là cần thiết cho việc cảm ứng sinh phôi soma (từ giai đoạn một tế bào đến khi hình thành những nhóm tế bào có khả năng sinh phôi), nhưng lại ức chế sự phát triển phôi ở các giai đoạn sau (Komamine và cs., 1993; Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự sinh phôi soma, có ít
nhất hai giai đoạn liên hệ mật thiết đến auxin: giai đoạn đầu cần có auxin và giai đoạn sau bị ức chế bởi auxin (Ammiranto và cs., 1983; Gleddie và cs., 1983) (Hình 1.15).
Hình 1.14. Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (2,4-D, NAA và IBA). (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Auxin)
Hình 1.15. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi soma (Bùi Trang Việt, 2000). Loại và nồng độ auxin đóng vai trò quan trọng nhất khi sử dụng auxin để tạo phôi soma. Ví dụ như ở đậu nành, so với 2,4-D thì NAA cho phôi soma giống phôi
hữu tính hơn; ở sâm Triều Tiên, 2,4-D có hiệu quả hơn NAA hoặc IAA. Furuya và cs. (1983) cho rằng 2,4-D cần thiết cho sự sinh trưởng của Panax ginseng, nhưng ở nồng độ cao (0,5 mg l-1
hoặc cao hơn) có thể gây ức chế sự sinh trưởng. Ở cây một lá mầm, nồng độ 2,4-D thấp dần cho số phôi ít nhưng phôi có phẩm chất tốt (tốc độ nẩy mầm cao, ít có phôi bất thường…). Việc ứng dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào kiểu phát triển cần nghiên cứu (mục đích thí nghiệm), hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy, khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh cũng như sự liên hệ của auxin với các chất khác, đặc tính của loại auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Đặc điểm hình thái của tế bào sau khi được cảm ứng để phát sinh phôi là sự di chuyển của nhân tế bào về gần vách và sự phân chia nhân xảy ra, hình thành hai tế bào con bất đối xứng (Iantcheva và cs., 2005). Tiếp theo, sự phân chia bất đối xứng là giai đoạn 4 – 8 tế bào. Sự phân chia kế tiếp dẫn đến sự hình thành khối tiền phôi với sự hiện diện của lớp biểu bì ban đầu, phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình thủy lôi và phôi hai lá mầm (Huỳnh Thị Đan San, 2009).
Auxin còn có vai trò trong sự hình thành các tế bào có khả năng sinh phôi là do chúng ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng sau đó. Trong nuôi cấy in vitro, khi xử lý auxin thì sự di chuyển hữu cực của auxin có vai trò như một chìa khóa trong sự thay đổi hình thái phôi. Sự thay đổi này xảy ra trong giai đoạn chuyển tiếp từ phôi hình cầu sang phôi hình tim ở cây hai lá mầm. Tế bào thiết lập tính hữu cực đã bị mất trước đó bằng cách thay đổi hướng vi ống, vị trí mặt phẳng phân chia và hướng kéo dài tế bào. Đây chính là sự kiện sớm nhất trong quá trình sinh phôi, tính hữu cực mới được tái lập nhanh chóng.
Theo Bùi Trang Việt, (2000) có ba bước thiết lập tính hữu cực của phôi là thành lập trục, phân hóa các cực chồi và rễ, phát sinh sơ khởi lá. Ở mức độ dưới tế bào, sự thành lập trục trong quá trình tiến hóa phôi phụ thuộc chặt chẽ vào sự định hướng của các PIN protein (protein vận chuyển auxin). Sự tích lũy auxin tại tế bào dây treo nhờ hệ thống các PIN 1, 4, 7 định vị hữu cực trong giai đoạn phôi hình cầu, cần thiết cho sự thành lập mô phân sinh rễ. Sau đó, trong giai đoạn phôi hình tim, sự
tích lũy auxin ở hai bên phía trên của phôi nhờ sự định vị hữu cực của PIN 1 giúp cho sự thành lập sơ khởi hai tử diệp đồng thời lúc này hình thành nên mô phân sinh chồi (Möller và Weijers, 2009). Sự định vị của các PIN protein trong sự tiến hóa phôi bị xáo trộn khi nuôi cấy phôi Arabidopsis trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D. Một trong những nguyên nhân làm cho auxin có thể tác dụng đáng kể đến sự phát sinh phôi soma là nó có ảnh hưởng lên sự biểu hiện gen, từ đó làm xuất hiện nhiều thay đổi khiến tế bào có thể tái lập được sang trạng thái sinh phôi (Friml và cs., 2003).
• Cytokinin
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật, sau đó di chuyển trong mạch gỗ tới chồi. Tuy nhiên, chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin. Cytokinin nội sinh và sự phân bào có mối tương quan rất chặt chẽ, nó cần thiết cho giai đoạn khởi đầu của quá trình phân bào, làm tăng tốc độ phân chia tế bào và định hướng sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cytokinin giúp tế bào gia tăng kích thước và sinh tổng hợp protein. Cytokinin tác động trên cả sự phân nhân và phân chia tế bào chất. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào. Cytokinin cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi, loại bỏ ưu thế ngọn và hạn chế sự phát triển của rễ (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong sự phát sinh phôi soma, cytokinin (Hình 1.16) là nhân tố chính kích thích quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi. Cytokinin cùng với auxin thúc đẩy sự phân chia tế bào, làm gia tăng số lượng tế bào trong phôi. Trong giai đoạn tạo phôi soma, sự giảm tỉ lệ auxin/cytokinin và sự di chuyển hữu cực của auxin là yếu tố cần thiết cho việc hình thành một trục xác định để phát triển cơ quan theo hướng nhất định, giúp phôi hình cầu tiếp tục phát triển. Cytokinin giúp tạo chồi, còn auxin với nồng độ thấp tạo rễ (Fujimura và Komamine, 1979; Torres, 1989). Nuôi cấy phôi hợp tử non trên môi trường chỉ bổ sung cytokinin để tạo phôi soma cũng đạt được những thành công ở các loài thực vật hạt kín và thực vật hạt trần. Trong
nuôi cấy phôi tâm cây nho, sự hình thành phôi xảy ra khi có sự hiện diện của cả NAA và BA (Mullins và Srinivasan, 1976).
Hình 1.16. Cấu trúc của một số dạng cytokinin. (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Cytokinin)
• Gibberellin
Gibberellin làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích. Auxin và gibberellin có vai trò thiết lập tính hữu cực ở mức tế bào đang tăng trưởng do tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào. Tuy nhiên, auxin và gibberellin có hoạt động độc lập, gibberellin không phải là tác nhân làm tăng khả năng hoạt động của auxin. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Hình 1.17), nó kích thích sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ rất thấp. GA3 có hiệu quả trong quá trình nẩy mầm của phôi, có tác dụng kích thích sự kéo dài chồi và nẩy mầm của phôi soma. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng trong nghiên cứu phát sinh phôi soma (Bùi Trang Việt, 2000).
Hình 1.17. Cấu trúc của GA3. (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Gibberellin-a3)
• Acid abscisic (ABA)
Acid absisic (Hình 1.18) là CĐHSTTV điều tiết trạng thái ngủ của hạt, chồi và điều tiết sự đóng mở khí khổng, đặc biệt khi cây ở vào điều kiện môi trường bất lợi (Nguyễn Như Khanh, 2009). Trong nuôi cấy in vitro, sự nẩy mầm sớm được kích thích bởi môi trường không có acid absisic, nhưng có nitrogen khử (glutamin) và carbon (sucrose).
Cho đến nay, có rất ít bài báo cáo về việc sử dụng ABA làm chất cảm ứng quá trình phát sinh phôi soma. ABA cũng có tác dụng tạo phôi soma, kích thích sự chín của phôi và sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật. Ngoài ra, ở tùng bách, kết hợp ABA (25 – 100 ppm) và than hoạt tính (0,05 – 0,25%) cải tiến mạnh chất lượng phôi soma (Bùi Trang Việt, 2000).
• Ethylen
Hầu hết các phần khác nhau của cơ thể thực vật bậc cao có thể sản sinh ra ethylen (Hình 1.19), tuy nhiên tốc độ hình thành phụ thuộc vào kiểu mô, giai đoạn phát triển của cơ thể. Các vùng mô phân sinh, mắt là nơi sản sinh ra nhiều ethylen. Ethylen được tạo ra trong quá trình chín quả, thời gian rụng lá, khi hoa già, khi mô bị tổn thương và dưới tác động của stress như ngập úng, lạnh, nhiệt độ bất lợi, bệnh, v.v. (Nguyễn Như Khanh, 2009).
Hình 1.19. Cấu trúc của ethylene (Smith, 1978).
Tiềm năng phát sinh phôi soma ở tế bào cà rốt nuôi cấy tỉ lệ nghịch với năng suất tổng hợp ethylen trong nuôi cấy (Feirer và Simon, 1991). Sự hiện diện của ethylen có vai trò cản trở sự hình thành phôi soma (Tisserat và Murashige, 1977; Cantliffe và cs., 1993). Theo Huang và Stavnezer (1971), các mô cà rốt nuôi cấy trên môi trường có auxin sản sinh nhiều ethylen hơn ở môi trường không có auxin. Ethylen làm giảm sự phân chia tế bào, gia tăng hàm lượng và tác động của ABA, giảm hàm lượng và tác động của giberellin (Abeles và cs., 1992). Chính điều này đã ngăn cản sự tăng trưởng phôi soma. Sự gia tăng tổng hợp ethylen trong quá trình sinh phôi soma làm giảm sự sinh tổng hợp các polyamine, một trong những yếu tố thúc đẩy sự sinh phôi soma. Ngoài ra, thành phần ethylen cao có thể tăng cường hoạt tính của enzym cellulase, pectinase hoặc cả hai, làm phá vỡ các cụm tế bào trước khi sự phân cực được thiết lập trong các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Chính điều này đã dẫn đến tác động ức chế quá trình phát sinh phôi soma của ethylen (Sharma và Rajam, 1995; Bajaj và Rajam, 1996).
1.2.4.4. Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi soma
Đường là nguồn năng lượng chính cho tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và tạo ra áp suất thẩm thấu cho môi trường. Sucrose là loại đường chủ yếu được sử dụng trong nuôi cấy tạo phôi soma.
Hàm lượng và dạng nitrogen trong môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng góp phần quyết định sự tạo phôi soma, mỗi loài thực vật thích hợp với những dạng nitrogen khác nhau trong quá trình nuôi cấy phôi cũng như trưởng thành phôi (Wetherell và Dougll, 1979). Sự có mặt của ion NH4+ rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phân hóa của phôi. Ngoài ra, sự sinh phôi không bao giờ thành công khi nitrat (NO3-) là nguồn nitrogen duy nhất. Nitrat cần cho phôi ở các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi (Halperin và Wetherell, 1965).
Các dịch trích có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, nội nhũ bắp, lúa mì, lúa, dịch chiết nấm men thường được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh phôi soma. Các dịch trích này luôn có ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và phát triển của phôi.
Sự phát sinh phôi soma có thể được cảm ứng trong tối hoặc dưới điều kiện được chiếu sáng. Ở một số loài cây, mô nuôi cấy trong tối được kích thích phát sinh phôi soma nhiều hơn khi nuôi ở ngoài sáng trên những môi trường có sự hiện diện của auxin. Khi nuôi cấy mô sẹo dưới điều kiện có ánh sáng sẽ xảy ra hiện tượng tiết phenol ra môi trường, chính những hợp chất này sẽ ngăn cản sự hấp thụ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của tế bào. Chất lượng của nguồn sáng cũng ảnh hưởng nhất định lên quá trình phát sinh hình thái của phôi soma vì có những vùng bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật (Nguyễn Bá Nam và cs., 2010).
Việc tạo vết thương trong quá trình tạo mô sẹo ở phiến lá, cuống lá hay đốt thân trước khi đặt vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo thường được rạch những đường ngang trên bề mặt mô cấy, vì trong một số trường hợp mẫu cấy không nhạy với việc xử lý CĐHSTTV nếu chúng không được tạo vết thương và sự tái sinh thường xảy ra tại các vị trí đó. Sự tạo vết thương kích thích sự vận chuyển hormon nội sinh tới vị trí vết thương, do đó kích thích sự tái sinh. Mặt khác, sự tạo vết
thương còn làm tăng sự hấp thu CĐHSTTV ngoại sinh thông qua vết thương (Huỳnh Thị Đan San, 2009).
Môi trường nuôi cấy (đặc, lỏng), thành phần và hàm lượng khoáng trong môi trường, vitamin, acid amin bổ sung vào môi trường, pH, độ ẩm đều có ảnh hưởng ít nhiều đến sự phát sinh phôi soma (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
CHƯƠNG 2.