Phôi soma là cấu trúc được hình thành và phát triển từ các tế bào sinh dưỡng, có thể phân hóa thành cấu trúc lưỡng cực (một cực hình thành rễ, cực kia tạo ra chồi) giống như phôi hợp tử và không có liên kết hệ thống mạch với tế bào gốc ban đầu, trong những điều kiện thích hợp có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh. Trong quá trình phát sinh phôi soma, tế bào sinh dưỡng đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển của phôi soma cũng trải qua các giai đoạn tương tự như sự sinh phôi hợp tử. Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi rễ. Sự phát sinh phôi soma dễ hay khó tùy từng loài, mô, tế bào thực vật và các điều kiện nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000; Dương Tấn Nhựt, 2009). Đặc điểm của phôi soma là có đặc tính di truyền giống cây mẹ, tạo được “hạt giống nguyên thủy” là phôi soma thay vì sử dụng hạt tự nhiên, sạch bệnh, loại bỏ điều kiện ngoại cảnh, diện tích canh tác, công chăm sóc và có thể đạt sản lượng cao trong thời gian ngắn (Nguyễn Ngọc Dung, 1995).
Bảng 1. 1. Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử
Phôi hợp tử (phôi hữu tính) Phôi soma (phôi vô tính) - Hình thành từ hợp tử (do sự thụ tinh
giữa giao tử đực và giao tử cái). Hợp tử lưỡng bội phân cắt nguyên nhiễm nhiều lần và phát triển thành phôi.
- Luôn đi kèm với nội nhũ, cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng cho quá trình nẩy mầm.
- Dây treo dài (Hình 1.10).
- Hình thành từ tế bào sinh dưỡng, trải qua quá trình phát triển như một cấu trúc phôi.
- Không có nội nhũ.
- Dây treo ngắn (sát với mô gốc) hoặc không nhìn thấy rõ (Hình 1.11).
Sự khác nhau giữa phôi soma và phôi hợp tử là sự tạo phôi soma không qua quá trình thụ tinh (Bảng 1.1). Vì vậy, phôi soma chỉ mang đặc điểm di truyền của tế
bào sinh dưỡng nên cây trưởng thành từ phôi soma giống hệt cây mẹ (Nguyễn Ngọc Dung, 1995).
Đặc điểm của tế bào phôi soma là tế bào chất đậm đặc, chứa nhiều hạt tinh bột lớn, hạch nhân lớn, bắt màu đỏ với phẩm nhuộm acetocarmin, hàm lượng protein và RNA cao, có biểu hiện hoạt tính dehydrogenase cao với thuốc thử tetrazolium (McWilliam và cs., 1974).
Hình 1.10. Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella.
(Nguồn:http://vietsciences1.free.fr/vietscience/biology/sinhhocdaicuong.htm)
Hình 1.11. Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.).
A- Phôi hình cầu, B- Phôi hình tim, C- Phôi hình thủy lôi, D- Phôi nẩy mầm, E- Tái sinh thành cây con. (Nguồn: http://www.as-bcst.sinica.edu.tw)
1.2.4.2. Sự phát sinh phôi soma
Các nghiên cứu về sự phát sinh phôi soma từ các bộ phận khác nhau của cây sâm Triều Tiên đã được tiến hành rất sớm: từ phôi hợp tử và lá mầm (Choi và Soh, 1994), từ mô sẹo của rễ và lá (Tirajoh và cs., 1998). Theo Chang và Hsing (1980), Asaka và cs. (1992, 1993), Tirajoh và cs. (1998), phôi soma của chi Panax sinh trưởng tốt trên môi trường rắn. Kevers và cs. (2000) đã sản xuất được phôi soma của cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) khi nuôi cấy trong môi trường lỏng.
Hình 1.12. Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ lá cây Phalaenopsis ‘Little Steve’. (a) Tế bào sinh phôi bắt nguồn từ tế bào biểu bì của lá (thanh ngang = 600 µm). (b) Phôi hình cầu chứa tế bào sinh phôi nhỏ và bắt màu đậm (thang ngang = 2 mm). (c) Phôi đang phát triển (thanh ngang = 1,6 mm).
(d) Phôi trưởng thành (thang ngang = 2 mm) (Nguồn: Kuo và cs., 2005).
Vị trí cảm ứng và kiểu phát triển của phôi soma biến đổi rất nhiều tùy theo loài cây và loại mô cấy. Phân tích mô học ở một vài loài thực vật cho thấy sự phát triển phôi soma có thể xảy ra từ biểu bì (Hutchinson và cs., 1996; Kuo và cs., 2005) (Hình 1.12), nhu mô hay những tế bào mạch (Ho và Vasil, 1983; Schwendiman và cs., 1988; Buffard-Morel và cs., 1992; Guerra và Handro, 1998).
Theo Sharp và cs. (1980), sự phát sinh phôi soma có thể theo hai con đường: (1) Phát sinh phôi soma trực tiếp nghĩa là phôi soma có thể hình thành trực tiếp trên
bề mặt của mẫu cấy, ví dụ như mô lá, thân, phôi hợp tử, phôi soma hay tế bào trần, hạt phấn. Trong sự hình thành phôi trực tiếp, tế bào nhu mô phát triển thành tế bào có khả năng sinh phôi. Các tế bào này sẽ phát triển thành phôi, chỉ cần điều kiện môi trường thích hợp để biểu hiện. Trong trường hợp này vẫn có sự hình thành khối mô sẹo trên bề mặt mẫu cấy nhưng sự tăng sinh của khối mô sẹo không đáng kể.
(2) Phát sinh phôi soma gián tiếp thông qua quá trình tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi hay từ dịch treo tế bào. Thông thường mô sẹo được tăng sinh dồi dào trước khi cảm ứng hình thành phôi. Trường hợp này, cần môi trường phù hợp để phản biệt hóa các tế bào nhu mô, tượng tầng hay mô phân sinh, nói chung là các tế bào còn có khả năng phân chia thành các tế bào biểu hiện khả năng sinh phôi. Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi thường có bề mặt mềm, có những điểm giống như mấu nhỏ; trong khi mô sẹo không có khả năng phát sinh phôi thì lại nhám, bở và có màu sáng đục (Quiroz-Figueroa và cs., 2006).
Phôi soma phát sinh trực tiếp có ít biến dị hơn phôi soma phát sinh gián tiếp thông qua mô sẹo, nhưng ở thực vật phát sinh phôi soma trực tiếp ít xảy ra hơn phát sinh phôi soma gián tiếp. Khác biệt giữa sự phát sinh phôi soma trực tiếp và gián tiếp vẫn chưa được hiểu rõ. Theo những giả thuyết trước đây, sự phát sinh phôi soma trực tiếp xảy ra từ những tế bào có nguồn gốc mô phân sinh. Các tế bào này có khả năng sinh phôi, luôn hiện diện và sự biểu hiện chương trình phát sinh phôi chỉ phụ thuộc vào những điều kiện thuận lợi. Ngược lại, phát sinh phôi soma gián tiếp lại xảy ra ở những tế bào đã biệt hóa nên đầu tiên phải tạo thành các mô sẹo chưa biệt hóa. Tuy nhiên, trong thực tế mô sẹo được tạo thành có thể gồm những tế bào có khả năng sinh phôi hoặc không có khả năng phát sinh phôi (Dương Tấn Nhựt, 2009).
Theo Nomura và Komamine (1986), các giai đoạn phát triển của phôi soma bao gồm (Hình 1.13):
- Giai đoạn tiền phôi: hình thành những cụm tế bào nhỏ có khả năng phát sinh phôi từ mô sẹo với sự bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy tạo phôi.
- Giai đoạn hình cầu: một nhóm tế bào lớn hơn có dạng hình cầu được hình thành với sự biểu bì hóa rõ ràng.
- Giai đoạn hình tim: sự hình thành các mô phân sinh chồi, rễ.
- Giai đoạn hình thủy lôi: sự kéo dài về hai cực của giai đoạn hình tim.
- Giai đoạn trưởng thành: sự hình thành lá mầm và rễ.
Hình 1.13. Các giai đoạn của sự phát sinh phôi soma ở dịch treo tế bào cà rốt (Nomura và Komamine, 1986).
A- Cụm tế bào sinh phôi; B- Phôi hình cầu; C- Phôi hình tim; D- Phôi hình thủy lôi muộn; E- Tái sinh cây con từ phôi soma.
Theo Bùi Trang Việt (2000), sự thu nhận phôi soma có hai giai đoạn quan trọng:
- Giai đoạn 1: Tạo các tế bào sinh phôi với sự bổ sung của riêng auxin hay kết hợp với cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Auxin mạnh cảm ứng tăng sinh tế bào nên tế bào phản phân hóa và mất tính hữu cực.
- Giai đoạn 2: Sự phát triển thành phôi soma với sự giảm hay loại bỏ auxin trong môi trường nuôi cấy giúp tế bào tái lập tính hữu cực và đi vào giai đoạn biệt hóa thành phôi soma.
1.2.4.3. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh phôi soma soma
CĐHSTTV là những chất với liều lượng rất thấp gây ra phản ứng sinh học cao, có vai trò điều tiết các quá trình sinh lý, trao đổi chất của cơ thể thực vật. CĐHSTTV là nhân tố quan trọng hàng đầu trong việc xác định chiều hướng phát triển của mẫu cấy trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhất là cảm ứng sự phát sinh phôi soma. Hầu hết những mô thực vật in vitro để phát sinh phôi soma đều được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CĐHSTTV ở nồng độ nhất định. Các loại CĐHSTTV được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào bao gồm auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen.
• Auxin
Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh ngọn, mô phân sinh lóng và lá non, sau đó di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ. Auxin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng, phân hóa mô dẫn, phát triển chồi, phát sinh rễ (Bùi Trang Việt, 2000).
Auxin là CĐHSTTV có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng sự hình thành và phát triển phôi soma (Komamine và cs., 1993; Yadav và Rajam, 1998). Trong số hơn 80% các nghiên cứu khoa học được công bố gần đây, việc cảm ứng quá trình sinh phôi soma đòi hỏi phải có sự hiện diện riêng của auxin hay kết hợp với cytokinin. Auxin được dùng nhiều nhất là 2,4-D (Hình 1.14). Các chất khác như NAA, IAA, IBA, picloram và dicamba cũng được sử dụng nhưng ở mức độ ít hơn (Bùi Trang Việt, 2000). Auxin có những ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn hình thành và phát triển phôi soma. Sự hiện diện của auxin là cần thiết cho việc cảm ứng sinh phôi soma (từ giai đoạn một tế bào đến khi hình thành những nhóm tế bào có khả năng sinh phôi), nhưng lại ức chế sự phát triển phôi ở các giai đoạn sau (Komamine và cs., 1993; Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự sinh phôi soma, có ít
nhất hai giai đoạn liên hệ mật thiết đến auxin: giai đoạn đầu cần có auxin và giai đoạn sau bị ức chế bởi auxin (Ammiranto và cs., 1983; Gleddie và cs., 1983) (Hình 1.15).
Hình 1.14. Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (2,4-D, NAA và IBA). (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Auxin)
Hình 1.15. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi soma (Bùi Trang Việt, 2000). Loại và nồng độ auxin đóng vai trò quan trọng nhất khi sử dụng auxin để tạo phôi soma. Ví dụ như ở đậu nành, so với 2,4-D thì NAA cho phôi soma giống phôi
hữu tính hơn; ở sâm Triều Tiên, 2,4-D có hiệu quả hơn NAA hoặc IAA. Furuya và cs. (1983) cho rằng 2,4-D cần thiết cho sự sinh trưởng của Panax ginseng, nhưng ở nồng độ cao (0,5 mg l-1
hoặc cao hơn) có thể gây ức chế sự sinh trưởng. Ở cây một lá mầm, nồng độ 2,4-D thấp dần cho số phôi ít nhưng phôi có phẩm chất tốt (tốc độ nẩy mầm cao, ít có phôi bất thường…). Việc ứng dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào kiểu phát triển cần nghiên cứu (mục đích thí nghiệm), hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy, khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh cũng như sự liên hệ của auxin với các chất khác, đặc tính của loại auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Đặc điểm hình thái của tế bào sau khi được cảm ứng để phát sinh phôi là sự di chuyển của nhân tế bào về gần vách và sự phân chia nhân xảy ra, hình thành hai tế bào con bất đối xứng (Iantcheva và cs., 2005). Tiếp theo, sự phân chia bất đối xứng là giai đoạn 4 – 8 tế bào. Sự phân chia kế tiếp dẫn đến sự hình thành khối tiền phôi với sự hiện diện của lớp biểu bì ban đầu, phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình thủy lôi và phôi hai lá mầm (Huỳnh Thị Đan San, 2009).
Auxin còn có vai trò trong sự hình thành các tế bào có khả năng sinh phôi là do chúng ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng sau đó. Trong nuôi cấy in vitro, khi xử lý auxin thì sự di chuyển hữu cực của auxin có vai trò như một chìa khóa trong sự thay đổi hình thái phôi. Sự thay đổi này xảy ra trong giai đoạn chuyển tiếp từ phôi hình cầu sang phôi hình tim ở cây hai lá mầm. Tế bào thiết lập tính hữu cực đã bị mất trước đó bằng cách thay đổi hướng vi ống, vị trí mặt phẳng phân chia và hướng kéo dài tế bào. Đây chính là sự kiện sớm nhất trong quá trình sinh phôi, tính hữu cực mới được tái lập nhanh chóng.
Theo Bùi Trang Việt, (2000) có ba bước thiết lập tính hữu cực của phôi là thành lập trục, phân hóa các cực chồi và rễ, phát sinh sơ khởi lá. Ở mức độ dưới tế bào, sự thành lập trục trong quá trình tiến hóa phôi phụ thuộc chặt chẽ vào sự định hướng của các PIN protein (protein vận chuyển auxin). Sự tích lũy auxin tại tế bào dây treo nhờ hệ thống các PIN 1, 4, 7 định vị hữu cực trong giai đoạn phôi hình cầu, cần thiết cho sự thành lập mô phân sinh rễ. Sau đó, trong giai đoạn phôi hình tim, sự
tích lũy auxin ở hai bên phía trên của phôi nhờ sự định vị hữu cực của PIN 1 giúp cho sự thành lập sơ khởi hai tử diệp đồng thời lúc này hình thành nên mô phân sinh chồi (Möller và Weijers, 2009). Sự định vị của các PIN protein trong sự tiến hóa phôi bị xáo trộn khi nuôi cấy phôi Arabidopsis trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D. Một trong những nguyên nhân làm cho auxin có thể tác dụng đáng kể đến sự phát sinh phôi soma là nó có ảnh hưởng lên sự biểu hiện gen, từ đó làm xuất hiện nhiều thay đổi khiến tế bào có thể tái lập được sang trạng thái sinh phôi (Friml và cs., 2003).
• Cytokinin
Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật, sau đó di chuyển trong mạch gỗ tới chồi. Tuy nhiên, chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin. Cytokinin nội sinh và sự phân bào có mối tương quan rất chặt chẽ, nó cần thiết cho giai đoạn khởi đầu của quá trình phân bào, làm tăng tốc độ phân chia tế bào và định hướng sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cytokinin giúp tế bào gia tăng kích thước và sinh tổng hợp protein. Cytokinin tác động trên cả sự phân nhân và phân chia tế bào chất. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào. Cytokinin cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi, loại bỏ ưu thế ngọn và hạn chế sự phát triển của rễ (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong sự phát sinh phôi soma, cytokinin (Hình 1.16) là nhân tố chính kích thích quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi. Cytokinin cùng với auxin thúc đẩy sự phân chia tế bào, làm gia tăng số lượng tế bào trong phôi. Trong giai đoạn tạo phôi soma, sự giảm tỉ lệ auxin/cytokinin và sự di chuyển hữu cực của auxin là yếu tố cần thiết cho việc hình thành một trục xác định để phát triển cơ quan theo hướng nhất định, giúp phôi hình cầu tiếp tục phát triển. Cytokinin giúp tạo chồi, còn auxin với nồng độ thấp tạo rễ (Fujimura và Komamine, 1979; Torres, 1989). Nuôi cấy phôi hợp tử non trên môi trường chỉ bổ sung cytokinin để tạo phôi soma cũng đạt được những thành công ở các loài thực vật hạt kín và thực vật hạt trần. Trong
nuôi cấy phôi tâm cây nho, sự hình thành phôi xảy ra khi có sự hiện diện của cả NAA và BA (Mullins và Srinivasan, 1976).
Hình 1.16. Cấu trúc của một số dạng cytokinin. (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Cytokinin)
• Gibberellin
Gibberellin làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích. Auxin và gibberellin có vai trò thiết lập tính hữu cực ở mức tế bào đang tăng trưởng do tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào. Tuy nhiên, auxin và gibberellin có hoạt động độc lập, gibberellin không phải là tác nhân làm tăng khả năng hoạt động của auxin. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Hình 1.17), nó kích thích sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ rất thấp. GA3 có hiệu quả trong quá trình nẩy mầm của phôi, có tác dụng kích thích sự kéo dài chồi và nẩy mầm của phôi soma. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng trong nghiên cứu phát sinh phôi soma (Bùi Trang Việt, 2000).
Hình 1.17. Cấu trúc của GA3. (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Gibberellin-a3)
• Acid abscisic (ABA)
Acid absisic (Hình 1.18) là CĐHSTTV điều tiết trạng thái ngủ của hạt, chồi và điều tiết sự đóng mở khí khổng, đặc biệt khi cây ở vào điều kiện môi trường bất lợi (Nguyễn Như Khanh, 2009). Trong nuôi cấy in vitro, sự nẩy mầm sớm được