cấy in vitro.
2.2.3.1. Mục tiêu
Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát sinh phôi soma ở cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm
• Thí nghiệm 3a:Mẫu thí nghiệm là phiến lá.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm 3a.
STT Tên NT
Ngày 0 - 20 Ngày 21 - 42 Ngày 43 - 84 Điều kiện CĐHSTTV (mg l-1) Điều kiện CĐHSTTV (mg l-1) Điều kiện IBA Kin IBA Kin
1 PIT Tối 2 0 Tối 2 0 Tối
MS1/2 2 PIS Tối 2 0 Sáng 2 0 Sáng
3 PIKT Tối 2 0,2 Tối 2 0,2 Tối 4 PIKS Tối 2 0,2 Sáng 2 0,2 Sáng
• Thí nghiệm 3b:Mẫu thí nghiệm là thân khí sinh.
Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm 3b.
STT Tên NT
Ngày 0 - 20 Ngày 21 - 42 Ngày 43 - 84 Điều kiện CĐHSTTV (mg l-1) Điều kiện CĐHSTTV (mg l-1) Điều kiện IBA Kin IBA Kin
1 TIT Tối 2 0 Tối 2 0 Tối
MS1/2 2 TIS Tối 2 0 Sáng 2 0 Sáng
3 TIKT Tối 2 0,2 Tối 2 0,2 Tối 4 TIKS Tối 2 0,2 Sáng 2 0,2 Sáng
2.2.3.3. Phương pháp thực hiện
- Mẫu cấy là 1 phiến lá hoặc 1 thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro. Phiến lá được cắt thành hình chữ nhật, ngang qua gân chính, chia thành 6 mảnh 5 x 2 mm (theo thứ tự từ ngọn đến cuống lá). Mặt dưới của phiến lá được đặt tiếp xúc với môi trường khảo sát (Hình 2.4, 2.5). Thân khí sinh được cắt ngang thành 4 đoạn dài 4 mm (vị trí 1 gần phiến lá, vị trí 4 ở gần gốc thân), cấy vào môi trường khảo sát (Hình 2.4, 2.5).
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hai yếu tố (CĐHSTTV và ánh sáng) hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi yếu tố có hai mức độ (Bảng 2.5, 2.6). Ở mỗi loại vật liệu, thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 đĩa petri (φ = 8 cm), lặp lại 3 lần. Mỗi đĩa chứa 25 ml môi trường mang 1 thân khí sinh và 1 phiến lá. Tổng số đĩa của thí nghiệm là 48, tổng số mẫu thí nghiệm là 48 mẫu phiến lá và 48 mẫu thân khí sinh. Đến ngày nuôi cấy thứ 43, chuyển tất cả mẫu cấy sang chai thủy tinh (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường không bổ sung CĐHSTTV. Chai được đặt nằm ngang.
- Môi trường thí nghiệm gồm khoáng đa lượng MS1/2, khoáng vi lượng MS, vitamin Morel bổ sung 30 g l-1 đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa, 200 mg l-1
KNO3, 400 mg l-1 KH2PO4, 8 g l-1 agar, pH được điều chỉnh trước khi hấp vô trùng là 5,8 ở 31oC. CĐHSTTV được bổ sung vào mỗi nghiệm thức theo các Bảng 2.5, 2.6. Môi trường được hấp khử trùng ở 121o
-Thời gian nuôi cấy là 84 ngày (12 tuần).
2.2.3.4. Điều kiện thí nghiệm
-Cường độ ánh sáng : 20 + 5 µmol m-2 s-1. -Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
-Nhiệt độ : 24 oC trong giai đoạn chiếu sáng và 22oC trong giai đoạn tối. -Độ ẩm tương đối : 75 + 5 %.
-Buồng nuôi cấy : tủ điều khiển khí hậu Percival.
2.2.3.5. Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian xuất hiện phôi đầu tiên (ngày). - Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%).
- Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%). - Số lượng phôi/mẫu.