in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. 2.2.4.1. Mục tiêu
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin lên sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm 4.
STT Tên NT Khoáng đa lượng MS Loại vitamin
1 MM MS Morel 2 2/3MM MS2/3 Morel 3 1/2MM MS1/2 Morel 4 MB MS Gamborg B5 5 2/3MB MS2/3 Gamborg B5 6 1/2MB MS1/2 Gamborg B5 2.2.4.3. Phương pháp thực hiện
- Mẫu cấy là 1 cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro mang 4 chồi, chồi có chiều cao 5 – 10 mm, trọng lượng tươi 100 + 20 mg (Hình 2.6).
Hình 2.6. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro (thang ngang = 1 mm). - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố A là thành phần khoáng đa lượng MS với ba mức độ (MS được giữ nguyên, MS giảm còn 1/2 hay MS giảm còn 2/3) và yếu tố B là loại vitamin có hai mức độ (vitamin Morel hay vitamin Gamborg B5) (Bảng 2.7). Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 bình (V = 130 ml), lặp lại 3 lần. Mỗi bình chứa 20 ml môi trường mang 1 cụm chồi. Tổng số bình trong thí nghiệm là 72, tổng số mẫu thí nghiệm là 72.
- Môi trường thí nghiệm gồm khoáng vi lượng MS bổ sung 30 g l-1 đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa, 200 mg l-1 KNO3, 400 mg l-1 KH2PO4, 8 g l-1 agar, pH được điều chỉnh trước khi hấp vô trùng là 5,8 ở 31oC. Khoáng đa lượng MS và vitamin được bổ sung vào mỗi nghiệm thức theo Bảng 2.7. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút.
-Thời gian nuôi cấy là 42 ngày (6 tuần).
2.2.4.4. Điều kiện thí nghiệm
-Cường độ ánh sáng : 20 + 5 µmol m-2 s-1. -Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
-Nhiệt độ : 20 oC trong giai đoạn chiếu sáng và 18oC trong giai đoạn tối. -Độ ẩm tương đối : 85 + 5 %.
-Buồng nuôi cấy : tủ điều khiển khí hậu Percival.
2.2.4.5. Chỉ tiêu theo dõi
-Số lượng chồi (chồi/mẫu). -Chiều cao chồi (mm). -Số lượng rễ (rễ/mẫu).
-Chiều dài rễ (mm).
-Trọng lượng tươi của mẫu (mg/mẫu). -Trọng lượng khô của mẫu (mg/mẫu). -Trọng lượng tươi của rễ (mg/mẫu). -Trọng lượng khô của rễ (mg/mẫu).
2.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.5.1. Mục tiêu
Khảo sát các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm 5.
STT Tên NT Khoáng
đa lượng, vi lượng Đường sucrose (g l-1)
1 M30 MS 30 2 M50 MS 50 3 S30 SH 30 4 S50 SH 50 5 G30 Gamborg B5 30 6 G50 Gamborg B5 50 7 C30 CLC 30 8 C50 CLC 50 2.2.5.3. Phương pháp thực hiện
- Mẫu cấy là 1 cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro mang 4 chồi, chồi có chiều cao trung bình 3 mm, trọng lượng tươi trung bình 50 + 5 mg.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố A là thành phần khoáng đa lượng, vi lượng với bốn mức độ (MS, SH, Gamborg B5 hay CLC) và yếu tố B là nồng độ đường sucrose với hai mức độ (30 hay 50 g l-1) (Bảng 2.8). Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình (V = 130
ml), lặp lại 3 lần. Mỗi bình chứa 20 ml môi trường mang 1 cụm chồi. Tổng số chai trong thí nghiệm là 120, tổng số mẫu nuôi cấy là 120.
- Môi trường thí nghiệm gồm vitamin Gamborg B5 bổ sung 10% (v/v) nước dừa, 8 g l-1 agar, pH được điều chỉnh trước khi hấp vô trùng là 5,8 ở 31oC. Đối với môi trường khoáng MS bổ sung thêm 200 mg l-1
KNO3, 400 mg l-1 KH2PO4. Khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose được bổ sung vào mỗi nghiệm thức theo Bảng 2.8. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút.
-Thời gian nuôi cấy là 49 ngày (7 tuần).
2.2.5.4. Điều kiện thí nghiệm
-Cường độ ánh sáng : 20 + 5 µmol m-2 s-1. -Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày.
-Nhiệt độ : 20 oC trong giai đoạn chiếu sáng và 18oC trong giai đoạn tối. -Độ ẩm tương đối : 85 + 5 %.
-Buồng nuôi cấy : tủ điều khiển khí hậu Percival.
2.2.5.5. Chỉ tiêu theo dõi
-Số lượng chồi (chồi/mẫu). -Chiều cao chồi (mm). -Số lượng rễ (rễ/mẫu). -Chiều dài rễ (mm).
-Trọng lượng tươi của mẫu (mg/mẫu). -Trọng lượng khô của mẫu (mg/mẫu). -Trọng lượng tươi của rễ (mg/mẫu). -Trọng lượng khô của rễ (mg/mẫu).