nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi
cấy in vitro.
Do sự giới hạn về thời gian làm đề tài nên kết quả của thí nghiệm này được báo cáo ở ngày nuôi cấy thứ 35. Thí nghiệm này vẫn được tiếp tục theo dõi tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật cho đến ngày thứ 84.
3.3.1. Thí nghiệm 3a: Nguồn vật liệu từ phiến lá
Các mẫu cấy lớp mỏng phiến lá bắt đầu phình lên vào ngày nuôi cấy thứ 21. Sau 7 ngày tiếp theo, một số mẫu cấy tạo mô sẹo, chủ yếu trên môi trường MS1/2 không có hoặc có bổ sung 0,2 mg l-1 Kin trong điều kiện nuôi cấy tối hoàn toàn. Vào ngày thứ 35, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 30,28% ở nghiệm thức PIT và 40% trong nghiệm thức PIKT (Hình 3.18). Mô sẹo có màu vàng, xuất hiện ở phần rìa của các mẫu cấy (Hình 3.19). Các mẫu cấy được nuôi trong tối 20 ngày rồi chuyển ra ngoài sáng có hiện tượng mất màu xanh và chuyển dần sang màu vàng từ vị trí vết thương từ ngày thứ 21 ở nghiệm thức có hoặc không có bổ sung 0,2 mg l-1 Kin, chưa thấy biểu hiện của sự phát sinh hình thái (Hình 3.19).
Hình 3.18. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro vào ngày thứ 35.
(P bên trái đại diện cho phiến lá; I, K bên phải đại diện cho IBA và Kin; T tượng trưng cho điều kiện tối, Stượng trưng cho điều kiện tối rồi chuyển ra sáng).
Hình 3.19. Mẫu cấy từ vị trí thứ 5 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 35 (thanh ngang = 1 mm).
(P bên trái đại diện cho phiến lá; I, K bên phải đại diện cho IBA và Kin; T tượng trưng cho điều kiện tối, Stượng trưng cho điều kiện tối rồi chuyển ra sáng).
30.28 40 0 10 20 30 40 50
PIS PIT PIKS PIKT
Tỉ lệ m ẫu tạo m ô sẹo (%) Nghiệm thức
3.3.2. Thí nghiệm 3b: Nguồn vật liệu từ thân khí sinh
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CĐHSTTV và ánh sáng lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 35.
Tên NTz Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%) Số rễ Chiều dài rễ (mm)
TIS 0 1,17 2,38 ax TIT 1,67 0,83 1,18 b TIKS 0 0 0 c TIKT 0 0,04 0,14 c ANOVAy CĐHSTTV (A) ns ** ** Ánh sáng (B) ns ns ns A x B ns ns * CV (%) 346,41 36,39 46,22 Chú thích: z
T bên trái đại diện cho thân khí sinh; I, K bên phải đại diện cho IBA và Kin, Ttượng trưng cho điều kiện tối, S tượng trưng cho điều kiện tối rồi chuyển ra sáng).
y
ns, *, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05 hay p < 0,01.
x các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo LSD-Test. • Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Các đoạn thân khí sinh bắt đầu phình lên ở phần gốc vào ngày nuôi cấy thứ 14. Sau đó, cả mẫu cấy phình to hơn. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ đoạn thân khí sinh ở ngày thứ 35 không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 3.5). Nghiệm thức có bổ sung 2 mg l-1
IBA nuôi cấy hoàn toàn trong tối có sự xuất hiện mô sẹo vào ngày thứ 21. Đến ngày thứ 35, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo ở nghiệm thức TIT chỉ đạt 1,67%. Mô sẹo có dạng khối tròn, màu vàng, xuất hiện ở phần gốc của mẫu cấy (Hình 3.20). Các nghiệm thức còn lại vẫn chưa có sự biểu hiện nào của mô sẹo (Bảng 3.5).
Hình 3.20. Mẫu cấy từ vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 35 (thanh ngang = 1 mm).
(T bên trái đại diện cho thân khí sinh; I, K đại diện cho IBA và Kin; Ttượng trưng cho điều kiện tối, Stượng trưng cho điều kiện tối rồi chuyển ra sáng).
Hình 3.21. Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy.
(T bên trái đại diện cho thân khí sinh; I, K đại diện cho IBA và Kin; Ttượng trưng cho điều kiện tối, Stượng trưng cho điều kiện tối rồi chuyển ra sáng).
0 0.4 0.8 1.2 1.6 14 21 28 35 Số rễ/m ẫu Ngày TIS TIT TIKS TIKT
• Số rễ (rễ/mẫu) và chiều dài rễ (mm/mẫu)
Từ đoạn thân khí sinh, mẫu cấy có sự hình thành rễ vào ngày nuôi cấy thứ 28 ở nghiệm thức TITS, TIT, TIKT (Hình 3.21). Vào ngày thứ 35, nghiệm thức TITS có số rễ hình thành cao (1,17 rễ/mẫu) với chiều dài 2,38 mm (Bảng 3.5). Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh giữa các nghiệm thức ở ngày thứ 35 không có sự khác biệt về mặt thống kê, nhưng chiều dài rễ lại khác biệt có ý nghĩa (Bảng 3.5).
Gendy và cs. (1996) đã tạo được mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy lớp mỏng tế bào của rễ và trụ thượng diệp cây kê Sorghum bicolor L. Moench. Sau 10 ngày nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn, tất cả các mẫu cấy đều tạo mô sẹo trên môi trường chứa 0,5 mg l-1 2,4-D hoặc bổ sung 0,5 mg l-1 2,4-D và 0,02 mg l-1Kin. Đến ngày thứ 15, mẫu cấy được chuyển ra điều kiện chiếu sáng với cường độ 100 µmol m-2 s-1. Trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg l-1
2,4-D và 0,02 mg l-1 Kin, 85% mô sẹo từ vị trí vùng gần đỉnh và vùng mô phân sinh đỉnh của trụ thượng diệp tăng sinh nhanh chóng và phôi soma xuất hiện sau 5 – 6 tuần nuôi cấy. Các mẫu cấy của cây
Sorghum bicolor cũng xuất hiện phôi hình cầu khi mẫu được cấy chuyền sang môi trường giảm nồng độ 2,4-D từ 2 mg l-1 xuống còn 0,5 mg l-1 và hình thành cây hoàn chỉnh trên môi trường không có auxin (Wernicke và Brettell, 1980). Từ rễ củ của cây sâm Việt Nam 3 năm tuổi, Nguyễn Ngọc Dung (1995) cũng đã nuôi cấy tạo mô sẹo trong tối ở nhiệt độ 22 – 25oC. Sau đó, mẫu được chuyển sang nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 3000 – 5000 Lux để phôi soma phát triển. Trong thí nghiệm này, chỉ quan sát thấy các mẫu cấy từ lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro tạo mô sẹo trong điều kiện tối sau 35 ngày nuôi cấy trên cả môi trường MS1/2 chứa 2 mg l-1
IBA hoặc môi trường có 2 mg l-1
IBA và 0,2 mg l-1 Kin. Trong khi đó, các mẫu cấy được cảm ứng trong tối 20 ngày và chuyển ra điều kiện chiếu sáng 20 + 5 µmol m-2 s-1chưa có sự đáp ứng tạo mô sẹo ở cùng thời điểm quan sát.
Năm 2009, Nguyễn Hữu Hổ và cs. cũng cho thấy rễ bất định có thể được tạo thành từ cây sâm Việt Nam in vitro trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25 – 28o
C. Các chồi sâm cao khoảng 2 – 3 cm được nuôi cấy trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 NAA và 1 g l-1 than hoạt tính, sau 3 – 4 tháng tạo ra nhiều rễ trắng, khỏe. Ở thí
nghiệm này, các đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro cũng tạo được các rễ trắng, to, nhiều lông hút từ ngày thứ 21 trên môi trường MS1/2 chứa 2 mg l-1
IBA (cả hai điều kiện tối và sáng) hoặc bổ sung 2 mg l-1
IBA và 0,2 mg l-1 Kin trong điều kiện tối. Số rễ và chiều dài rễ đạt tốt hơn trên môi trường chỉ có 2 mg l-1 IBA trong điều kiện tối hoặc trong tối 20 ngày rồi chuyển ra ngoài sáng ở cường độ ánh sáng 20 + 5 µmol m-2 s-1 (Hình 3.21).
Tóm lại, ở ngày nuôi cấy thứ 35 của thí nghiệm này vẫn chưa thấy xuất hiện phôi soma ở bất kỳ nghiệm thức nào. Do đó, thí nghiệm được theo dõi tiếp tục đến ngày thứ 42 và mẫu cấy sẽ được chuyển sang môi trường MS1/2 không có CĐHSTTV để theo dõi việc cảm ứng tạo phôi soma.